体外抗氧化实验方案

一 DPPH 自由基清除法 原理 DPPH 1 1 Diphenyl 2 picrylhydrazyl radical 即 1 1 二苯基 2 苦基肼基自由基 分子中 由于存在 多个吸电子的 NO2和苯环的大 键 所以 氮自由基能稳定存在 NN O2N O2N NO2 当 DPPH 自由基被清除 其最大吸收波长 519nm 处的吸光度 A 值随之减小 DPPH 这种稳定的自由 基为清除自由基活性的检测提供了一个理想而又简单的药理模型 实验步骤 1 1 DPPH 测试液的配制 6 25 10 5M 取 DPPH 0 0246g 溶于约 100mL 溶剂甲醇中 超声 5min 充分振摇 务使上下各部分均匀 取 1mL 该 DPPH 溶液 在 519nm 处测 A 值 使 A 1 2 1 3 之间最佳 该 DPPH 溶液最好避光保存 3 5 小时内 用完 1 2 样品液的配制 Vc 溶液 0 25mg ml 称取 Vc 0 01125g 溶于 45mL 乙醇溶液 1 3 预试 取 DPPH 溶液 2mL 往其中加少量样品液 加样时 先少后多渐加 边加边混合 并观察溶液的褪 色 m 情况 当溶液颜色基本褪去时 记下样品的加样量 此加样量即为样品的最大用量 在此最大用量的基础上 往前设置 5 个用量 使之成等差数列 如 在预试过程中 发现加样到 200 L 时 DPPH 溶液颜色基本褪去 则 200 L 为该样品液的最 大用量 其用量梯度宜设为 40 80 120 160 200 L 浓度梯度 mg ml 为 0 0025 0 0050 0 0100 0 0200 0 0400 g ml 2 5 5 10 20 40 1 4 测量 A0值的测量 取 DPPH 溶液 2 mL 加入到小试管 或玻璃瓶 中 加 95 甲醇 1mL 充分混合 测 A 值 517nm 此 A 值为 A0 A0多在 0 7 0 9 之间 A 值的测量 取 DPPH 溶液 2mL 加入到小试管 或玻璃瓶 中 加样品液 x L x 是根据 1 3 预试结果确定样 品液的用量 再加 1000 x L 甲醇 混合 静置 30 分钟后 测 A 值 517nm 加样表如下 表1 加样表 样品液甲醇DPPH测试液总体积 30 L970 L 2 mL3mL 60 L940 L 2 mL3mL 120 L880 L 2 mL3mL 240 L760 L 2 mL3mL 480 L520 L 2 mL3mL 1 5 正式测量 方法大致与 1 4 相同 只不过 每测一个用量需要测三个平行数据 而且在每测一个用量的三个平行 数据后 都要重测一次 A0 实验结果 清除率 抑制率 的计算公式 0 0 100 AA Inhibition A 二 二 FRAP 法分析维生素法分析维生素 C 抗氧化作用抗氧化作用 实验原理实验原理 参照 Benzie 与 Strain 的方法 原理为 Fe3 三吡啶三吖嗪 TPTZ 可被样品中还原物 质还原为二价铁形式 呈现出蓝色 3 并于 593nm 处具有最大光吸收 根据吸光度大小计算 样品抗氧化活性的强弱 实验试剂实验试剂 醋酸钠 三水 冰醋酸 TPTZ FeCl3 6H2O FeSO4 6H2O 不同梯度不同梯度 FeSO4溶液配制溶液配制 称取 695mgFeSO4 6H2O 定容至 25ml 即 100mM 按梯度配 制成 10 25 100 150 200 400 500 M 溶液 TPTZ 工作液配制工作液配制 1 称取 1 02g 乙酸钠 三水 加 4ml 冰醋酸 定容至 25ml 调整 pH 3 6 2 称取 TPTZ 粉末 7 8mg 小心腐蚀皮肤 溶于 2 5ml 40mM HCl 溶液中 溶液澄清透明 3 称取 1 35g FeCl3 6H2O 溶于 25ml 水中 取 2 5ml 溶液定容至 25ml 即 20mM 的 FeCl3 溶液 混匀三种溶液 10 1 1 制成 TPTZ 工作液 现配现用 不同梯度不同梯度 Vc 溶液配制溶液配制 取 Vc 溶于水 配成含 Vc5 10 20 30 40 50 g ml 溶液 预实验 实验步骤实验步骤 1 标准曲线的测定 按 10 1 1 比例 精确量取醋酸钠溶液 TPTZ 溶液和不同梯度 FeSO4 溶液 混匀后于 37 反应 10min 测定 593nm 处吸光度 以醋酸钠溶液调零 以 FeSO4浓 度为纵坐标 表示为 FRAP 值 吸光度为横坐标 绘制 FRAP 标准曲线 2 取 100 L 不同浓度的 Vc 溶液 加入 1