微生物可行性报告完整版

重重组组 HSV 新型溶瘤病毒疫苗可行性新型溶瘤病毒疫苗可行性报报告告 学 院 生物工程学院 专业班级 生工 1501 班 学生姓名 吕永斌 指导教师 裘娟萍 摘要摘要 经过重组减毒的 型溶瘤单纯疱疹病毒在体外具有良好的溶瘤效果 经过 研究 目前已经能建立以 Vero 细胞为基质的重组 HSV 一 病毒疫苗反应器微 载体无血清悬浮培养生产工艺 最大病毒滴度可达到 6 62 lgTCID50 ml 以上 为以 Vero 细胞为基质的无血清病毒疫苗规模化培养提供了一种简便 高效的工 艺方法 可计划用于工业化生产 关关键词键词 重组 HSV Vero 细胞 生物反应器 微载体培养 正文 1 产品的意义 目前恶性肿瘤已超过心脑血管类疾病成为首位人类致死性疾病 采用 Vero 细胞培养技术生产的重组溶瘤性 型单纯疱疹病毒 HSV 具有良好的溶源性 靶向性和安全性 具有重要的应用价值 国内人类肿瘤疫苗的有关研究处于刚起步状 态 面临多重难题 建立高效的肿瘤疫苗生产工艺具有非常重要的社会和经济价值 经 过重组减毒的 型溶瘤单纯疱疹病毒作为高效新型病毒疫苗有望用于肿瘤的临床研究 图 1 溶瘤病毒的作用机制 2 生产材料 细胞培养 Vero 细胞 病毒株 重组 型溶瘤单纯疱疹病毒 HSV II 中国医学科学院肿瘤研究所提供 微载体 Cytodex 1 生物反应器 图 2 产品外观 图 3 Cytodex 1 微载体 图 4 Vero 细胞 图 5 生物反应器 3 经济效益 经查阅 ATCC Vero 细胞为免费 不包邮 病毒株需向中国医学科学院肿瘤研究所申请 提供 几乎免费 微载体 Cytodex 1 市价为 3 元 瓶 生物反应器可租借 成本保守估计 不算设备使用费 每支成本约为 6 元 预售价为 98 元 除去设备费和人 工生产费 约可净得利润 30RMB 支 1ml 4 生产工艺流程 图 6 生产车间流程图 在反应罐培养间中进行重组 HSV 病毒疫苗的微载体悬浮培养 步骤如下 Cytodex 1 微载体制备 称取一定量 Cytodex l 置于二甲基二氯硅烷硅化的转瓶 瓶 子内 加入 PBS pH 7 2 水化 比例约为 80 150 mL g Cytodex 1 约 3h 后将 PBS 倾去 加入新 PBS 继续水化约 3 h 可过夜 倾去并用新的 PBS 洗涤一次 高压灭菌 121 30min 冷却后倾去 PBS 用培养基洗涤一次后倾去 重新加入新鲜培养基 置 4 冰箱平衡过夜 待用 PBS 继续水化约 3 h 可过夜 倾去并用新的 PBS 洗涤 一次 高压灭菌 121 30 min 冷却后倾去 PBS 用培养基洗涤一次后倾去 重新 加入新鲜培养基置 4 C 冰箱平衡过夜 待用 Vero 细胞的生物反应器培养 Cytodex 1 浓度为 3 g L 接种密度 2O 30 cells MC 转速 45 r min 温度 37 C 溶解氧浓度 DO 通过 Air O 和 N 的进气 比控制在 40 空气饱和度 pH 通过调节 CO 的进气量和 7 5 w v NaHCO 控制 在 7 15 7 2 进行 1 5 L 5L 反应器培养 Vero 细胞的微载体球转球转移培养 Vero 细胞于转瓶 反应器内微载体上培养 2 4d 待长成单层时 向培养基中加入一定体积的新微载体 与长满细胞的老微载 体按照一定比例混合 进行间歇 连续搅拌培养 待细胞转移贴附成功后 进行常规 连续搅拌培养 Vero 细胞的微载体在位消化转移培养 Vero 细胞于转瓶 反应器内微载体上培养 2 4d 待细胞长成单层 即处于指数生长期时 进行在位消化转移培养 首先停止 搅拌 待微载体沉降完全后将培养基排出 用 37 C 温浴的 PBS 以约 150 ml PBS g MC 的体积洗涤两次 向微载体内加入 37 C 温浴的胰蛋白酶 含 0 02 W V EDTA 50 ml g MC 缓慢搅拌约 2 min 后倾去胰酶液 静止待细胞变圆后 以一定的 比例加入含新微载体的培养基 并以一定转速快速搅拌约 2 min 后 补足培养基并 以 35 40 r min 的初始搅拌转速连续搅拌培养 约培养 12 h 待细胞在微载体上完 全贴附后 将微载体悬液放大到下一级生物反应器内进行培养 重组 HSV 病毒的反应器培养 Vero 细胞于反应器内微载体上培养 2 4d 待细胞 生长至 80 90 汇合时 接种病毒 接毒时将反应器内培养基排出并用 PBS 洗 涤 2 次 加入含 BSA 的无血清病毒维持液 VD LSM 同时将培养温度由 37 C 降 为 32 进行病毒培养 待细胞病变至 80 90 后 将培养液进行 4 C 盐裂解 收获病毒 根据计数结果用 Reed Munch 公式计算 TCID50 待细胞病变后收获病毒 5 高效构建技术路线 利用病毒活性增效剂 辅助因子 与重组 HSV 病毒疫苗共同左右 增强产品效力 具体方案如下 首先选择几种能够增强病毒活性的增效剂 M1 M2 M3 M4 设 计实验选出能够有效增强该溶瘤病毒的增效剂 设置 5 个相同的培养基 合适的 PH 温度和 渗透压 放入等量肿瘤细胞作为唯一营养物质 1 4 号分别加入相同剂量的 M1 M2 M3 M4 增效剂 5 号加入等量生理盐水作为对照 放在适宜的环境下培养一定时间后分别对 5 个培 养基中的肿瘤活细胞进行计数 统计并肿瘤活细胞最少的那一组 可以初步得出最佳增效剂 后期反复实验已确定前面结果的正确 最后选出最佳增效剂并适量加入到溶瘤病毒疫苗中 确认其安全性后投入到临床应用 6 产品的质量标准 规格 本品为注射剂 1ml 支 每 1 次人用剂量为 1ml 病毒滴度 6 00 lgTCID50 ml 重金属 含重金属不得超过百万分之十 接种部位 手臂三角肌肌肉 无菌检査 依法检査 通则 1101 应符合规定 重组病毒疫苗的 GMP 标准 i 在工作场所 保护工人远离生物制剂暴露的风险 ii 操作规范 正确谨慎处理转基因释放的 微 生物体或生物体含有重组 DNA 分子 iii 保证人或兽用生物制品和药品的安全性 vero 细胞来源的安全性等 7 参考文献 1 Montagnon B Fanget B Nicolas A The large scale cultivation ofVERO cells in micro carrier culture for virus vaccine production Preliminary results for killed poliovirus vaccine Developments in biological standardization 1981 47 55 2 Barrett P N Mundt W Kistner O et a1 Vero cell platform invaccine production moving towards cell culture based viralvaccines Expert review of vaccines 2009 8 5 607 618 3 Dennehy P H Rotavirus vaccines an overview Clinicalmicrobiology reviews 2008 21 1 198 208 4 Tauber E Kollaritsch H Korinek M et a1 Safety and immunogenicity of a Vero cell derived inactivated Japanese encephalitis vaccine a non inferiority phase III randomised controlled tria1 The Lancet 2007 370 9602 1847 1853 5 Howard M K Kistner O Barrett P N Pre clinical development of cell culture Vero 一 derived H5N1 pandemic vaccines Biologicalchemistry 2008 389 5 569 577 6 Ahmedin Jemal Freddie Bray Melissa M Center et a1 Global cancer statistics CA a cancer joumal for clinicians 201 1 61 2 69 90 7 Michael J T John O D Melissa M C The global bu en ofcancer priorities for prevention Life Sciences and Medicine 2010 31 1 100 110 8 Audrey L R Danielle J Julia T et a1 Scalable production ofinfluenza virus in HEK 2 93 cells for efficient vaccine manufacturing Vaccine 2010 28 21 3661 3671 9 Allen Chen Swan L P Christian D et a1 Serum freemicroearrier based production of replication deficient Influenzavaccine candidate virus lacking NS1 using Vero cells BMC Biotechnology 2011 11 81 10 Maranga L Brazilo T F Carrondo M J Virus like particle production at low multiplicities of infection with the baeulovirus insect cell system Biotechnol Bioeng 2003 84 2 245 53 11 Kallel H Rourou S Majoul S et a1 A novel process for the production of a veterinary rabies vaccine in BHK 21 cells grown on microcarriers in a 20 1 bioreactor Applied Microbiology and Biotechnology 2003 61 5 441 446 12 Kunal A Frank J Luis M et a1 Bioprocess optimization for cell culture based influenza vaccine production Vaccine 201 1 29 3320 3328 13 施桂兰 庄秀芬 韩香萍 等 新型溶瘤病毒 oHSV2hGM CSF 的构建及其抗肿 瘤作用 中华肿瘤杂志 2012 34 2 89 95 Shi G L Zhuang X F Han X P et al Constru ction of a newoncolytic virus oHSV2hGM CSF and its anti tumor effects Chinese iourual of oncology 2012 34 2 89 95 14 龚迪 易小萍 张元兴 MDCK 细胞微载体悬浮培养放大工艺研究 中国生物工 程杂志 2012 32 009 55 60 GongD Yi X P Zhang Y X A study on scale up process for microcarrier cultue of MDCK cells using low seru m medium China Biotechnology 2012 32 009 55 60 15 Lehtinen M HSV infected RAJI cells specify HSV specific immediate early and or early DNA binding proteins Archives ofVirology 1986 87 1 2 107 118 16 张立 严春 范卫民 等 Vero 细胞的微载体培养 放大过程中的接种工 艺 华东理工大学学报 自然科学版 1998 24 006 659 663 Zhang L Yan C Fan W M et a1 Inoculum technology in large scaleeell cultur