西北农林科技大学-生物技术综合大实验

生物技术综合大实验 原核系统表达的 绿色荧光蛋白的纯化 宋捷 2012014069 纪成功 孔令浩 王玉康 王鹏程 董奉新 西北农林科技大学 摘要 绿色荧光蛋白 GFP 的提纯是一套十分成熟的蛋白质提纯系统 本 教学实验使用原核的大肠杆菌系统 通过转化带有 GFP 基因的原核表达载 体到 BL21 表达菌株中 通过氨苄抗性筛选 用阿拉伯糖诱导表达 通过硫 酸铵盐析 疏水层析 阴离子交换柱层析 凝胶过滤层析 各级纯化用紫 外显色和 SDS 凝胶电泳检测 终末纯化后纯度较高 本实验较为成功的提 取提纯了 GFP 并较好训练蛋白质提纯技术 关键词 GFP 蛋白提纯 疏水层析 离子交换层析 凝胶过滤层析 1 介绍 GFP 最早是由下村修等人在 1962 年在一种学名 Aequorea victoria 的水母中发 现 其基因所产生的蛋白质 在蓝色波长范围的光线激发下 会发出绿色萤光 分子 质量约为 27kd 有 238 各氨基酸基团 三维结构为 圆柱 圆柱两端由一些较短的 螺旋盖住 圆柱中央是几段 螺旋 生色团位于圆柱中央 该结构性质稳定 本 实验通过该分子的较为稳定 疏水特性 易电离成阳离子 分子较小的体征 选择盐 析 疏水层析 阴离子交换层析 凝胶过滤层析逐级提纯 GFP 2 材料和方法 2 1 pGFP 质粒克隆及提取 质粒是已经构建完成的 GFP 基因表达由易受阿拉伯糖诱导的启动子控制 及常表达 的氨苄抗性 碱裂解法 试剂实验室自配 提取 取 1ml 菌液于 1 5ml 离心管 1000rpm 离心 30s 弃上清 加入 100 l 提质粒溶液 I 震荡混匀 加入 200 l 溶液 II 温和混匀置至于冰上 5min 加入 150 l 溶液 III 混匀 置于 冰上 5min 1000rpm 离心 3min 转移上清于另一新 1 5ml 离心管 加入 900 l 无 水乙醇 混匀 室温静置 3min 12000rpm 离心 5min 弃上清 待其干燥 于 30 l TE 中溶解 冰上暂存 2 2 转化 取 1 5ml OD600 0 3 0 4 BL21 冰浴 30min 4000rpm 离心 10min 弃上清 加 入 200 l 0 1M CaCl2 悬浮沉淀 冰浴 15min 4000rpm 离心 10min 弃上清 加入 200 l 0 1M CaCl2 悬浮沉淀 备用 取 1 l 质粒 DNA 加入制备好的感受 态细胞 温和混匀 置于冰上 30min 42 C 水浴锅 热击 45 60s 冰浴 10min 加入 900 l LB 培养基 37 C 150rpm 震荡培养 30min 涂板 LBp ara 37 C 温育过夜 2 3 筛选重组子及扩大培养 将平板放置紫外灯下检测 标记 挑取绿色荧光单菌落 于 5mlLB amp 培养 基中 37 C 150rpm 震荡培养 7 小时 吸取 2ml 菌液 置于 200mlLB amp ara 培养基中 37 C 150rpm 振荡培养过夜 本组的平板并无 可视菌落 所以挑去他组菌落 2 4 收菌破碎 收集菌液 200ml 于 250ml 离心管 共 4 管 5000 xg 离心 10min 弃上清 每管 30ml 溶解缓冲液 50mM Tris HCl 1mmol L EDTA 重悬沉淀 将 4 管合并为 1 管 每管加入 60 l 溶菌酶 混匀 将离心管置于冰上 超声波破碎仪探头插入离心管 探头离底部约 1cm 且不触 离心管壁 900w 超声 3s 静止 3s 共 8min 重复 3 次 7500 xg 离心 15min 在紫外灯下观察沉淀 留样 和上清 留样 取上清备用 2 5 盐析 取上清定容至80ml 取10ml做预实验 用溶解缓冲液稀释至100ml 分装至 10只试管 每管10ml 称取不同浓度梯度 NH4 2SO4 见下表 室温静置 15min 各取1ml于1 5ml离心管 7500rpm离心15min 在紫外灯下观察GFP沉 淀情况 可看出 第五管 NH4 2SO4含量50 时出现沉淀 杂蛋白 第八管 NH4 2SO4含量80 沉淀量最大 GFP 在剩余70ml上清中加入20 37g NH4 2SO4 含量50 室温静置30min 7500rpm离心15min 取上清 加入 36 12 g NH4 2SO4 含量80 室温静置15min 7500rpm离心15min 弃上清 20 C保存 NH4 2SO 4 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 NH4 2SO 4 g 0 701 061 642 262 913 614 365 166 037 06 2 6 疏水层析 配制 平衡缓冲液 2mol ml NH4 2SO4 TE PH8 0 start buffer A 1 3mol ml NH4 2SO4 TE PH8 0 洗脱缓冲液B 10mM Tris 1mM EDTA PH8 0 将沉淀好的GFP用10ml 平衡缓冲液溶解 9000rpm离心10min 移上清液至另一大 离心管备用 连接仪器 蒸馏水洗柱 确保仪器运行正常 填装柱材 Phenyl Sephadex CL 4B 用3倍体积 约120ml 的平衡缓冲液平衡柱子 转速29转 分 将含 GFP的上清液上柱 3倍体积 约120ml 洗脱缓冲液洗脱 转速60转 分 紫 外灯观察GFP运动情况 结合层析图谱 当GFP快要流出时 收集 收集下来的 液体留样 剩下部分装入处理好的透析袋中 用离子交换层析的start buffer A 20mM Tris HCl pH7 0 透析过夜 2 7 阴离子柱层析 配制 start buffer A 20mM Tris HCl pH7 0 洗脱缓冲液B 20mM Tris HCl pH7 0 含1M NaCl 将疏水作用层析的透析袋用 PEG10000 浓缩 start buffer A 洗柱 填装柱材 DEAE Sephadex A 50 用 3 倍体积 约 120ml 的 start buffer A 平衡柱子 转 速 30 转 分 将含 GFP 的浓缩液上柱 3 倍体积 约 120ml start buffer A 及 洗脱缓冲液 B 梯度洗脱 转速 60 转 分 紫外灯观察 GFP 运动情况 结合层 析图谱 当 GFP 快要流出时 收集 收集下来的液体留样 剩下部分装入处理 好的透析袋中 用凝胶过滤层析的缓冲液 20mM Tris HCl pH7 0 透析过夜 2 8 凝胶过滤层析 配制缓冲液 20mM Tris HCl pH7 0 将离子交换层析的透析袋用 PEG10000 浓缩 缓冲液洗柱 填装柱材 Sephadex G 75 用 3 倍体积 约 120ml 的缓冲平衡柱子 将含 GFP 的浓 缩液上柱 缓冲液洗脱 紫外灯观察 GFP 运动情况 结合层析图谱 当 GFP 快 要流出时 收集 收集下来的液体留样 剩下部分装入处理好的透析袋中 用 PEG10000 浓缩 浓缩好的液体收集备用 2 9 SDS 凝胶电泳检测 3 实验结果 GFP 用硫酸盐最佳沉淀点的选择 收集硫酸铵浓度在 50 80 的蛋白质沉淀 3 1 3 级层析图谱 疏水层析图谱 收集紫外荧光显色较亮的四管 对照图中区域大约如箭头所示 陡升由于调高了敏 感度 离子交换柱层析 收集紫外荧光显色较亮的 3 管 对照图中区域大约如箭头所示 凝胶过滤层析 图中所显示区域未收集 在所示时间外有一管带微弱荧光 收集 3 2 SDS page 电泳图 3 3 自左向右箭头所指条带依次是 1 他组三级纯化产物 2 本组三级纯化微弱荧光样品 3 离子交换纯化产物 4 离子交换层析传出 wash 5 Maker 6 疏水层析产物浓缩 产物 7 疏水层析产物 8 疏水层析 wash 9 细胞破碎后上清 10 细胞破碎 液体 可靠性较高的 1 2 3 9 10 标示泳道 蓝色箭头位置推测为目标条带 4 分析与讨论 4 1 本组的重组子平板次日早晨检查时并没有可视菌落出现 继续培养 到下午是可看 到 2 到 3 个绿色的重组子群落 分析可能是 1 转化后菌株过于脆弱2 可能氨苄涂抹 过多3 涂布器使用时未控制好温度 4 2 在用硫酸盐沉淀的时候 我总是主张直接用最大浓度硫酸盐直接沉淀 应该是有问 题的 GFP 有明显的荧光信号 很容易在盐析粗提的时候去除溶解性相差较大的杂蛋 白 4 3 细胞破碎后收集的液体有十分明亮的荧光 GFP 的疏水性较强 可与柱材上疏水基团 结合 在盐离子浓度降低时解离 疏水层析结果如图 推测前几个峰出现时洗掉了 数个杂带 可惜 SDS 电泳时失误 并不能看出哪些条带被洗掉 在装自装柱时 由 于我并不熟练 导致柱子上盖胶条不紧 以及忘记初始化自动收集装置 阀门就没 开 使得在平衡柱子的时候不停漏液 耽误了进度 也浪费了柱子 4 4 离子交换柱有十分好的纯化效果 目的蛋白区域有极高的吸收峰 局部浓度可能过 高 下次要减缓流速 因为无法测量当时离子浓度 并不能给蛋白解离离子浓度区 域给出建议 从电泳图上看 第三道 目标蛋白十分清晰 在上方存在数个杂蛋白 5 个 4 5 凝胶过滤层析时 出现了数个失误 1 改变柱子压力位置 2 转速过大 压力过大 3 柱子填充过多 吸出一部分重装填 导致凝胶分层 后期大量蛋白卡在分界面 4 与组员没有商讨好实验方案 导致中途实验进程不顺利 5 出现下方爆管 凝 胶及蛋白漏出 重装填后不能洗出 电泳图上出现大量抖峰 是管内出现气泡所致 原因可能如下 1 从下方给予负压 且流速过大 2 下方的管口漏气 一侧缝隙我们添加了液体 并未漏泄 接口处可能 漏液 3 凝胶的缝隙中本身有空气 4 buffer 并未排气 在负压条件下溶解的空 气被析出 4 压强过低出现真空泡 由于出现了大量蛋白卡在分界面上 且前期从电泳图上看到分离出约两种杂蛋白 我们采取了倒出胶体重新装柱 重新洗脱的方法 所以紫外吸收图谱并未记录 4 6 凝胶电泳的分离胶是我配的 一块水封时候用力过大 出现了凹面 并未有多余 所以只好自用 对点样结果的的美观性有影响 组员点样的时候可能出现失误 使 得 5 6 7 8 与位置不符合 可能未点上 从前三个泳道分析 小韦组结果十分好 目标条带及其明亮 可能我们组拿的并不是波峰管 所