猪肝酯酶农药敏感性及其与胆碱酯酶的对比研究.doc

猪肝酯酶农药敏感性及其与胆碱酯酶的对比研究 1536西南农业学报Southwest ChinaJournal ofAsricultural Sciences2018年3l卷7期V0131No710014829 (2018)7153607DOI1016213jkiscjas20187034猪肝酯酶农药敏感性及其与胆碱酯酶的对比研究杨莉1，王羚佳1，开拓1，黄玉坤1，黄瑛2，杨潇1，陈祥贵H(1西华大学食品与生物工程学院，食品生物技术省高校重点实验室，四川成都610039；2四川省食品药品检验检测院，四川成都611731)摘要【目的】探讨猪肝酯酶(PLE)对农药的敏感性，为农药残留快速检测提供新的敏感酶源。 【方法】以乙酸一1一萘酯为底物，考察PLE酶促反应的最适温度、pH及几种农药的最佳作用时间，同时比较了PLE对几种特异性酶抑制剂的敏感性；以电鳗乙酰胆碱酯酶(AChEee)、马血清丁酰胆碱酯酶(BChEhs)为对照酶源，采用酶抑制法，绘制5种有机磷农药(敌百虫、敌敌畏、甲胺磷、辛硫磷、毒死蜱)和5种氨甲酸酯类农药(灭多威、克百威、丁硫克百威、残杀威、涕灭威)的抑制曲线，并计算相关半抑制率(Ic50)，比较各种酶的农药敏感性。 【结果】猪肝酯酶酶活测定方法的最佳温度、时间、pH分别为35、15min、70；农药最适作用时间为15min；猪肝酯酶对双(4硝基苯基)磷酸酯敏感性最高，毒扁豆碱次之，盐酸多奈哌齐最低；与胆碱酯酶相比，猪肝酯酶对供试的多数有机磷农药和氨甲酸酯类农药的IC50更低，敏感性更好。 【结论】猪肝酯酶具有良好的农药敏感性，可以作为酶抑制法农药残留快速检测的候选酶源。 关键词猪肝酯酶；胆碱酯酶；酶抑制法；农药；敏感性$48l+8AComparative Studyof PesticideSensitivity ofPorcineLiver Esteraseand CholinesteraseYANGLil，WANG Ling-jial，KAI Tu01，HUANG Yukun91，HUANG Yin92，YANG Xia01，CHEN Xiang-guil+(1School of Food andBioengineering，Xihua University，Key LaboratoryofFoodBiotechnology ofSichuan ProvincialUniversity，SiehuanChengdu610039China2Siehuan ProvincialInstitute forFood andDrug Control，Sichuan Chengdu611731，China)Abstract【Objective】In thepresent paper，the sensitivityofporcine liveresterase(PLE)to pesticidewas studiedtofind outanew sourceofsensitive enzymefor therapid detectionof pesticideresidues【Method】Employing theacetic acid-1naphthyl esteras substrate，the optimum temperature，pH and the bestreaction timefor severalpesticides ofPLE werestudied，and thesensitivities ofPLE toseveral specificenzymeinhibitors were paredUsing enzyme inhibition methodwith electric eel Acetyl cholinesterase(AChEee)and horseserum Butyrylcholinesterase(BChEhs)as parison，then theinhibition ratecurve offivekinds oforganophosphorus pesticides(O，OdimethylO2，2-diehlorovinylphosphate；Dipterex；Methamidophos；phoxim；Chlorpyrifos)and fivekinds ofearbamate pesticides(Methomyl；Carbofuran；earbosulfan；propoxur；aldiearb)were plotted，their relativehalf-inhibitory concentration(IC50)were calculated，andthenthe sensitivitiesofthe enzymesto pesticidewerepared【Result】The optimumconditions ofmeasuring PLE activity asfollowstemperature Was35，time was15minand pHwas70The optimumreaction timeof pesticidewasl5rain；The mostsensitive toPLE Wasbis(4-nirophenyl)phosphate，followed byphysostigmine，andthelowest Wasdonepezil hydroehloride；Comparing withesterases，PLE formost organophospho-Ills pesticidesand carbamatepesticides hada lowerIC50and wasmore sensitive【Conclusion】PLE hada goodpesticide sensitivity，whichcould beused asa sensitiveenzyme seurcein theenzymeinhibitionmethod for rapid detectionof pesticideKey wordsAeetylcholinesterase；Butyrylcholinesterase；Porcine liveresterase；Enzyme inhibitions；Organophosphorns pesticides；Metal；Sensitivityxx0710基金项目国家自然科学基金 (31271872)；四JII省学术带头人培养基金；四川省重点研发项目(食品中有毒有害化学物质监控平台建设)作者简介杨莉(1990一)，女，四川达州人，硕士研究生，食品营养与安全，Email724041383qq$为通讯作者陈祥贵，博士，教授，硕士生导师，食品营养与安全，Emailchenxiangguimailxhueduca。 【研究意义】农药残留是世界各国当前面临的食品安全问题之一?。 我国是一个农业大国，农药使用量大面广，监管相对困难，农药残留的快速检测对于保障食品安全具有重要意义12。 4j。 酶抑制法是目前国内外农药残留快速检测中应用最广泛的方法j，该方法主要原理是有机磷和氨基甲酸酯类万方数据7期杨莉等猪肝酯酶农药敏感性及其与胆碱酯酶的对比研究1537农药可特异性地抑制胆碱酯酶的活性，因此在体外检测中待测样品对酶活性的抑制率与样品中有机磷和氨基甲酸酯类农药的含量呈正相关司1。 【前人研究进展】自1962年Guilbault采用胆碱酯酶检测农药以来一j，国内外大量的相关研究促进了酶抑制法的发展与应用，但存在酶源单 一、灵敏度低等问题。 各类商品化的检测用酶源主要是家蝇、电鳗和电鳐的乙酰胆碱酯酶0。 ，且大多数研究报道集中在各类传感器的开发，而对新型酶源的研究较少【11。 12。 羧酸酯酶是一类广泛存在于各种生物的酶，生态毒理学研究提示羧酸酯酶对农药具有较好的敏感性，可作为酶抑制法的候选酶源lI3|，但目前相关研究不多，其实践应用还鲜有报道。 Gary等人研究揭示了不同酯酶对有机磷抑制剂具有不同的敏感性，猪肝酯酶对供试的几种有机磷化合物具有较好的敏感性，但仅测试了2种常用有机磷农药，且未与目前快速检测中常用的胆碱酯酶进行敏感性对比4|。 【本研究切人点】猪肝酯酶丰富、廉价，因此本文选用猪肝酯酶为酶源，以AChEee、BChEhs为对照，同时测定并比较3种酶对农药的敏感性，【拟解决的关键问题】为进一步研究猪肝酯酶作为酶抑制法的酶源提供试验依据。 1材料与方法11材料与主要试剂电鳗乙酰胆碱酯酶(AChEee，Acetylcholinesterase ofelectriceel)、马血清丁酰胆碱酯酶(BChEhs，Butyryl cholinesteraseof horseserum)、猪肝酯酶(PLE，Porcine liveresterase)，购自美国Sigma公司。 农药标准品敌百虫、敌敌畏、甲胺磷、辛硫磷、毒死蜱、灭多威、克百威、丁硫克百威、残杀威、涕灭威，购自国家农药质检中心。 碘化硫代丁酰胆碱(BTChI；sButyryhhiocholineiodide)、乙酸一l一萘酯、固蓝B盐、毒扁豆碱(Eser-ine)、盐酸多奈哌齐(Donepezil Hydrochloride)，购自美国Sigma公司；碘代硫代乙酰胆碱(ATChI；SAcetylthiocholine iodide)、5，5二硫代-2，2二硝基苯甲酸(DTNB；5，5-dithiobis一(2-nitrobenzoic acid)，购自美国Fluka公司；双(4-硝基苯基)磷酸酯(BNPP；Bis(4一nitrophenyl)phosphoric acid)，购自日本TCI公司；其他试剂均为分析纯。 12仪器与设备3599酶标板，ing公司；Infinite砣00荧光化学发光分析仪，瑞士Tecan公司；Research?plue单道可调移液器，德国Eppendorf公司；高速冷冻离心机，centrifuge5810R，德国Eppendorf公司；电子天平，TB-214，北京赛多利斯仪器有限公司；分光光度计，UV2600A，上海龙尼柯仪器有限公司。 13实验方法131PLE酶活的测定PLE敏感性的测定方法参照邓光辉等的Ellman法，并有一定的改进卜161，作为底物的乙酸一1萘酯被PLE分解为乙酸和甲萘酚，甲萘酚与固蓝B盐作用，生成紫红色偶氮化合物，在590nm处有吸收。 在96孑L板中依次加人50斗l002moVL(pH65)的磷酸缓冲液、50wl PLE和100wl10mM乙酸一1一萘酯液，混匀后，在40下保温反应一定时间后，加入100恤l025固蓝B盐，在590nm处测量其OD值，计算酶相对活力。 132温度对PLE酶活的影响分别在 25、 30、 35、 40、45oC，pH65条件下，测定酶活力，并以最适反应温度下的酶活力作为100计算。 每处理重复3次。 133pH对PLE酶活的影响分别在pH5 5、6 0、6 5、7 0、7 5、80条件下，35恒温反应，测定酶活力，并以最适反应pH下的酶活力作为100计算。 每处理重复3次。 134酶特异性抑制剂对PLE酶活的影响在酶促反应体系中，分别加人50斗l210、210、210、210山molL的BNPP、毒扁豆碱、盐酸多奈哌齐溶液，测定酶活力，以不加抑制剂的酶活力作为100计算。 每处理重复3次。 135农药对PLE的最佳作用时间取4种有机磷农药(敌敌畏、敌百虫、久效磷、甲胺磷)以及2种氨基甲酸酯农药(克百威、灭多威)用丙酮溶解成浓度为210叫molL的母液，并用002molL pH70磷酸缓冲液梯度稀释至210一molL，按照131方法分别与PLE反应，测定不同反应时间下对PLE酶活的抑制率。 酶抑制率计算公式为4一d抑制率H()=竺100AO其中A。 无抑制时反应体系的OD值；A，有农药抑制时反应体系的OD值。 136AChE-ee敏感性的试验方法AChEce敏感性的测定参照何绍志的ELLman方法，并有一定的改进J，作为底物的碘化硫代乙酰胆碱被AChEee分解为乙酸和硫代胆碱，硫代胆碱与DTNB作用，生成黄色的络合物，在410nm波长处测其光密度(OD)。 设置3组对照组，一组无底物ATChI和农药，一组无AChE-ee和农药，另一组无农药；另外设置6万方数据西南农业学报31卷组实验组，按照预先配制好的农药溶液，将有机磷农药敌敌畏、敌百虫、甲胺磷、辛硫磷、毒死蜱和氨基甲酸酯类农药灭多威、克百威、丁硫克百威、残杀威、涕灭威依次加人反应体系中。 体系以PB为反应底液，先加入5003AChE-ee和50“l农药溶液，在37下保温10min；再加入10003ATChI和100山IYFNB，在410RITI光源处测量其10min内的OD值。 不足300山的体系用PB补足，每个处理重复3次。 137BChEhs敏感性的试验方法BChEhs敏感性的测定方法参照VGorun改进的Ellman法20o，作为底物的碘化硫代丁酰胆碱被BChEhs分解为丁酸和硫代胆碱，硫代胆碱与DTNB作用，生成黄色的络合物，在410nm波长有吸收。 设置3组对照组，一组无底物BTChI和农药，一组无BChEhs和农药，另一组无农药；另外设置6组实验组，按照预先配制好的农药溶液，将136提到的农药依次加入反应体系中。 体系以PB为反应底液，先加入5003BChEhs和50斗l农药溶液，在37下保温10min；再加入10003BTChI和10003DTNB，在410nm光源处测量其10min内的OD值。 不足30003的体系用PB补足，每个处理重复3次。 138PLE敏感性的试验方法PIE敏感性测定方法参照邓光辉等Ellman法，并有一定的改进5|。 设置3组对照组，一组无底物乙酸1萘酯和农药，一组无PLE和农药，另一组无农药；另外设置6组实验组，按照预先配制好的农药溶液，将136提到的农药依次加入反应体系中。 体系以PB为反应底液，先加入5003PLE和50l农药溶液，在37下保温10min；再加入10003乙酸1萘酯在37下反应10min；最后加入10003固蓝B盐，在590nm光源处测量其10min内的OD值。 不足30003的体系用PB补足，每个处理重复3次。 以一lgC为x坐标，以抑制率日()为Y坐标，绘制折线图。 100零80恤蓑602025303540455055温度(oC)图1温度对酶活性的影响Fig1Effect oftemperature onPLE activity139农药半抑制浓度(IC铀)的计算方法根据不同浓度的农药(C，molL)对酶的抑制率(日，)，参照冯艳萍等旧川的计算方法，以农药终浓度一lg(c)为横坐标，lg日(1一日)为纵坐标绘制曲线，当所得曲线方程Y=0时，即H=1一H，抑制率H=50，所求得的x对应的浓度c值即为半抑制浓度IC50值。 2结果与分析21温度对酶活性的影响由图1可知，PLE在温度为35时酶活力最高，为其最佳反应温度；温度过高或过低均导致酶活力的降低。 22pH对酶活性的影响pH是影响酶活的主要参数之一，由图2可知，PIE最适反应pH值为70。 23反应时间对PLE酶活的影响实验从525min范围内，反应时间对PLE酶活影响如图3所示，最佳反应时间是15min。 24抑制剂对PLE酶活性的影响毒扁豆碱是胆碱酯酶抑制剂，盐酸多奈哌齐是AChEee特异性抑制剂，双(4一硝基苯基)磷酸酯是羧酸酯酶抑制剂，三者对PLE的抑制作用如图4所示。 100姜80札蓑60*一零妖嫂溢靛罂5055606570758085pH值图2plt对PLE酶活测定的影响Fig2Effect ofpH onPLE activityO51015202530时间(min)Time图3反应时间对PLE酶活测定的影响Fig3Effect oftime onPLE activity万方数据7期杨莉等猪肝酯酶农药敏感性及其与胆碱酯酶的对比研究15393456抑制剂浓度的负对数(一togC)图4酶抑制剂对猪肝酯酶活力的影响Fig4Effect ofinhibitom onPLEactivity由图4所知，在实验浓度范围(10一10。 toolL)，盐酸多奈哌齐仅在10。 molL时对PLE有抑制效果，并且只有4882；当浓度为10。 molL时，毒扁豆碱与BNPP对PLE完全抑制；当浓度为104molL时，BNPP对PLE能够完全抑制，而毒扁豆碱抑制率为9044；当浓度为10。 5与10娟molL时，BNPP对PLE的抑制率依然高于毒扁豆碱，并且高于70以上。 由此可知，PLE对3种抑制剂敏感性的顺序为BNPP毒扁豆碱盐酸多奈哌齐。 25农药对PLE的最佳作用时间由图5可得，敌敌畏、敌百虫、克百威对PLE的抑制效果显著，在325min实验范围内，抑制率保持在90。 而灭多威、甲胺磷、久效磷在的抑制率随着抑制时间的延长而逐渐上升，当在15min之后，抑制率日()变化不显著，趋近于稳定。 因此，农药对PLE的最佳作用时间为15min。 反应时间(min)Time图5作用时间对猪肝酯酶活力的影响Fig5Effect ofreaction timeOn PLEactivity26不同浓度的有机磷农药对酶的抑制作用图6为5种常见有机磷农药(敌敌畏、敌百虫、甲胺磷、辛硫磷、毒死蜱)分别对PLE、AChEee以及BChEhs的抑制率折线图。 从图6可以看出，随着农药浓度的降低，5种农药对3种酶的抑制率均呈下降趋势。 当农药浓度为10。 3molL时，除毒死蜱外，其余4种农药对3种酶的抑制均达到最大值。 当农药浓度在10一10。 6molL时，抑制率随农药浓度降低而迅速降低。 当农药浓度低至108molL时，5种农药对3种酶的抑制均低于20。 同种农药在不同浓度下，酶源的敏感性不相同；当农药浓度为10“molL时，敌敌畏与敌百虫对PLE与BChEhs的抑制率均达到95以上，而对AChEee的抑制率却只有87左右。 当农药浓度为10qmolL时，敌敌畏与敌百虫对AChEee的抑制率依然有20以上，而对PLE与BChEhs的抑制率均低于10。 表13种醋酶对5种有机磷农药敏感性对比Table1Comparison ofenzymsensifivity infive organophphoms pIicid加印加0万方数据1540西南农业学报31卷注Y为lgl爿(1一H)j，X为一lgc。 27不同浓度的氨基甲酸酯类农药对酶的抑制作用图7为5种常见氨基甲酸酯类农药(灭多威、克百威、丁硫克百威、残杀威、涕灭威)分别对PLE、AChEee以及BChEhs的抑制率折线图。 当农药浓度为10。 molL时，5种氨基甲酸酯农药对PLE的抑制率均达到90以上，随着浓度降低，同等浓度下不同种农药对PLE的抑制率逐渐不同。 此外，同种酶源对不同种农药的敏感性不同，当农药浓度为10。 6molL时，克百威与残杀威对AChEee的抑制率可达到80，灭多威与丁硫克百威却仅为70左右，涕灭威甚至只有40左右；丁硫克百威对BChE-hs抑制率可达到80以上，克百威仅50左右，灭多威、残杀威、涕灭威却不到20。 由此可知，PLE对灭多威最敏感，其次是AChEee，BChEhs最末。 28PLE及AChEee、BChEhs农药敏感性比较根据生态毒理学中IC铀值与酶对农药敏感性的关系，IC卯值越小，表明酶对其越敏感。 本文以lineweaverBurk法分析5种常见有机磷农药和5种常见氨基甲酸酯类农药在不同浓度下对3种酶源的抑制结果，由表l2可知，农药浓度与抑制率的相关性均达到90以上，表明线形关系良好。 PLE、AChEee及BChEhs对不同有机磷农药的敏感性顺序分别为敌敌畏PLEBChEhsAChEee；敌百虫PLEAChEeeBChEhs；甲胺磷AChEeePLEBChEhs；辛硫磷BChEhsAChEeePLE；毒死蜱PLEBChE-hsAChEee。 PLE、AChEee及BChEhs对不同氨基甲酸酯类的敏感性顺序分别为灭多威AChEeePLEBChEhs；克百威AChEeePLEBChEhs；丁硫克百威PLEAChEeeBChEhs；残杀威AChE-eeeePLEBChEhs；涕灭威PLEAChE-eeBChE-hs。 5种有机磷农药中，PLE对敌敌畏、敌百虫、毒死蜱的敏感性均高于AChEee与BChEhs，其中敌百虫与毒死蜱均比AChEee与BChEhs提高1个数量级；而对甲胺磷与辛硫磷，PLE与AChEee均处于同1数量级。 因此，PLE对有机磷农药的敏感性跟AChEee或BChEhs有着显著的差异，并且在针对某一特定农药时，以IC如值为对照，其敏感性可比AChEee与BChEhs高12个数量级，比如毒死蜱。 5种氨基甲酸酯农药中，PLE对涕灭威与丁硫克百威的敏感性均高于AChEee与BChEhs，其中对丁硫克百威的敏感性比AChEee高1个数量级，比BChEhs高2个数量级。 PLE对灭多威、克百威、残杀威的敏感性虽然不如AChEee，甚至对灭多威与克百威的敏感性比AChEee还低1个数量级，但与BChEhs处于同一量级。 因此，PLE对氨基甲酸酯农药的敏感性跟BChEhs有着显著差异，甚至针对某一特定农药，如丁硫克百威，其敏感性可比万方数据7期杨莉等猪肝酯酶农药敏感性及其与胆碱酯酶的对比研究APLE对有机磷农药的抑制率；BAChEee对有机磷农药的抑制率；CBChE-hs对有机磷农药的抑制率图6酶对有机磷农药抑制率的影响Fig6Inhibiting effectof enzymesactivity onorganophoshorus pesticidesAPLE对氨基甲酸酯类农药的抑制率；BAChEee对氨基甲酸酯类农药的抑制率；cBChE-hs对氨基甲酸酯类农药的抑制率图7酶对氨基甲酸酯类农药抑制率的影响Fig7Inhibiting effectof enzymesactivity Oncarbamate pesticidesAChEee或BChEhs高l一2个数量级。 畏、敌百虫、甲胺磷、辛硫磷、毒死蜱的Ic，。 值分别为3讨论猪肝酯酶是从猪肝中提取的一种羧酸酯水解酶，它是使用最广泛合成光学活性醇的酯酶，在水解羧酸酯酶时具有高度立体选择性22|，且其价格低廉，广泛，对大多数农药有良好的敏感性，实用价值高，可作为寻找新敏感酶源的实验材料。 本研究系统试验了PLE酶学性质、与AChEee和BChEhs进行农药敏感性对比研究，为PLE用于农药残留快速检测提供了依据。 农药能够抑制生物体内胆碱酯酶的活性，引起神经系统中毒。 不同的胆碱酯酶在结构上差异明显，表现出对农药不同的敏感性。 AChEee对氨基甲酸酯类农药甲萘威、速灭威的IC，。 值分别为1 002、7568ixmolL“；BChEhs对和氨基甲酸酯类农药灭多威、速灭威的IC值分别为22 58、2418la,molL旧3|；本实验AChEee对有机磷农药敌敌畏、敌百虫、甲胺磷、辛硫磷、毒死蜱的IC，。 值分别为5 812、2 405、10 870、6 570、1000la,molL，对氨基甲酸酯类农药灭多威、克百威、丁硫克百威、残杀威、涕灭威的Ic值分别为0 340、0 045、0 046、0 069、0871txmolL；BChEhs对有机磷农药敌敌5 110、3 440、57 370、0 359、278i山molL，对氨基甲酸酯类农药灭多威、克百威、丁硫克百威、残杀威、涕灭威的IC值分别为34 140、0 930、0 236、12 6、555I山molL。 本研究与已有研究数据趋势一致。 Gary等人研究表明，猪肝酯酶对毒死蜱的IC，。 为00101I山molL，对敌敌畏的IC50为110IJtmolL；本文PLE对有机磷农药敌敌畏、敌百虫、甲胺磷、辛硫磷、毒死蜱的Ic铀值分别为1 133、0 542、18 08、11 90、1806I山molL，对氨基甲酸酯类农药灭多威、克百威、丁硫克百威、残杀威、涕灭威的Ic，。 值分别为5 527、02590 01、0 098、0791I山moLL。 PLE对农药敌敌畏敏感性与Gary等人研究结论基本一致；PLE在敌敌畏、敌百虫、毒死蜱的敏感性上明显优于AChEee，并且5种有机磷农药的敏感性全部优于BChEhs；PLE在丁硫克百威、残杀威、涕灭威的敏感性上与AChEee基本一致，本研究的5种氨基甲酸酯类农药与BChE-hs相比，敏感性明显更强。 基于实验环境、实验操作等因素影响，相同酶源在不同测定条件下，得出结果可能不同旧4I。 李德玲等研究了PLE对毒死蜱的敏感性51，表明猪肝酯酶能较好地用于毒死蜱检测。 目前对猪肝酯酶农药敏万方数据1542西南农业学报31卷感性研究数据还不完善，本实验数据表明，PLE对氨基甲酸酯类农药的敏感性可以达到Ixmol水平，与前人研究一致；对毒死蜱的敏感性也在l上mol水平。 PLE可作为快速检测农药残留的酶源。 4结论猪肝酯酶活性测定方法的最佳温度、时间、pH分别为35、15min、70；农药对猪肝酯酶的最适抑制时间为15min；本实验结果表明，猪肝酯酶对BNPP敏感性最高，毒扁豆碱次之，最低为盐酸多奈哌齐，此结果进一步证明了猪肝酯酶对水解羧酸类化合物有特异性。 通过对5种有机磷农药和5种氨基甲酸酯类农药对PLE、AChEee、BChEhs的酶活性进行比较，发现PLE无论对有机磷农药还是氨基甲酸酯类农药的敏感性都要优于BChEhs；与AChEee相比，除了有机磷农药甲胺磷、辛硫磷，氨基甲酸酯类农药灭多威、克百威外，PLE的敏感性更好。 PLE具有广泛，易于提取，价廉等优点。 猪肝中PLE含量丰富，对氨基甲酸酯类的农药敏感性高，与常用的胆碱酯酶相比，对多数有机磷农药的敏感性较好，可作为酶抑制法快速检测农药残留用酶的候选酶源。 参考文献1周仕涛我国植物源农药的研究及前景J西南农业学报，xx (4)5255292刘颖我国农药使用现状、原因及对策研究JI$I-I-与自然资源研究，xx (4)50513顾宝根我国生物农药的现状及发展前景J农资科技，2000 (2)22234叶亚平，单正军我国农药环境管理状况及对策研究J农村生态环境，xx，18 (1)625李晓婷，王纪华，朱大洲，等果蔬农药残留快速检测方法研究进展J农业工程学报，xx(s2)3633706陈威，钟国才，王亚军，等基于酶抑制的有机磷农药残留快速检测方法进展J广东农业科学，xx，231531547俞发荣，李登楼有机磷农药对人类健康的影响及农药残留检测方法研究进展J生态科学，xx (3)1972038杜美红，孙永军，汪雨，等酶抑制比色法在农药残留快速检测中的研究进展J食品科学，xx，31 (17)4624669Guilbauh GG，Kmmer DN，Jr PLCElectrical DeterminationofOrganophosphomus CompoundsJAnalytical Chemistry，1962，34 (11)1437143910余孝颖有机磷农药对不同生物的胆碱酯酶选择性抑制的研究J环境科学，1996 (4)4143+9311Amine A，Arduini F，Moscone D，et a1Recent advancesin biosensors basedon enzymeinhibitionJBiosensorsBioelectronics，xx7618019412Guerrieri A，Monaci L，Qui