医学标书范文3VIP

医学标书范文医学标书范文3 3 河南省科技攻关计划项目申请书姓名JiangDongbao项目名称FGFR4表 达对结直肠癌细胞株生物学行为的影响及作用机制的研究单位郑州 大学联系电话填报说明请根据自己的专业及研究方向 针对某具体 临床问题 结合所学习临床科研方法的一种或几种写出一份科研设 计 完成后 文件以个人姓名命名 发至1736601711 qq 考核成绩依设计书优略评定 截至日期xx年11月8日 1 一 项目的立项依据和意义 说明国内外相关领域技术发展水平和 趋势等 结直肠癌 colorectal cancer CRC 是起源于结直肠黏膜上皮的恶性肿瘤 是临床最常见 的恶性肿瘤之一 我国每年结直肠癌新发病例超过25万 死亡病例约14万 新发与死 亡病例均占全世界同期结直肠癌病例的20 1 局部进展期结直肠癌5年癌症相关生存率为70 而发生远处转移的 晚期结直肠癌5年生存率仅为12 且生活质量低 目前结直肠癌新辅助化疗 辅助化疗 姑息化疗方案很多 如ECF DCF 奥沙利铂 氟尿嘧啶 顺铂 氟尿嘧啶等 但其最核心的药物是 氟尿嘧啶 在此基础上联合其他化疗药物 近年来 靶向药物在结直肠癌治疗领域的研究和应用成为一大热点 作用于EGFR的爱必妥 作用于VEGF的贝伐单抗 针对Her 2的赫赛汀等已进入胃癌治疗的临床实验中 成纤维生长因子受体 FGFRs 是一个多基因家族 属免疫球蛋白基 因超家族成员 是分布在多种细胞上的膜蛋白 FGFR家族成员有FGFR 1 FGFR 2 FGFR3以及FGFR4 它们的特点是在胞膜外含有3个免疫球蛋白样结构域 一个疏水的跨 膜结构 胞浆内含有两个呈串联结构的酪氨酸激酶功能区 FGFR1 3在体内是广泛分布的 而FGFR4主要在发育早期大量表达 而 且主要分布在视网膜和肾脏 编码FGFR4蛋白的FGFR4基因位于5号染色体 5q35 1 qter 基因编号为2264 FGFR4蛋白是一类具有自身磷酸化活性的跨膜酪氨酸激酶受体中的一 种 在胚胎发育 组织修复和血管形成等进程中起着十分重要的作用 2 3 但FGFR4在恶性肿瘤中的研究相对较少 Pubmed检索该分子在胃癌中 的研究仅见几篇报道 而且研究尚不深入 但有学者认为 FGFR家族是在恶性肿瘤诊治方面是一个新兴的领域 有广阔的应用前景 4 FGFR4在常见的恶性肿瘤如乳腺癌 胰腺癌 横纹肌肉瘤及肾细胞癌 中均呈高表达 5 7 Meijer D等报道FGFR4表达是复发性乳腺癌患者的独立的预后因素 8 Mila no等研究亦认为FGFR4可以预测三苯氧胺治疗乳腺癌的疗效 9 Gowardhan等 10 研究报道 与良性增生相比 FGFR4在前列腺癌中 的表达显著上调 FGFR4的表达与Gleason评分相关 生存分析显示 FGFR4过表达与较差的预后相关 无病生存期缩短 Ho HK等对57对肝细胞肝癌组织及对应的正常组织进行real timePCR定量检测FGFR4在mRNA水平的表达 统计结果显示 FGFR4的 表达与患者的主要临床病理资料无相关性 可能是由于样本量较小 11 Streit等 12 通过免疫组化技术对137例恶性黑色素瘤组织标本进行 FGFR4蛋白水平表达进行检测 结果显示 FGFR4在恶性黑色素瘤组 织标本中的表达率为45 FGFR4的表达与肿瘤临床分期 微溃疡形 成 原发灶的数目 总生存期及无病生存期均有明显相关性 作者 认为FGFR4蛋白的表达可作为恶性黑色素瘤进展的潜在指标 自xx年 Bange等 13 发现了FGFR4Gly388Arg这一胚系多态性后 该 SNP现已成为了一个研究的热点 该SNP是位于FGFR4第9外显子388密码子上 碱基G转变为A 导致了F GFR4的氨基酸序列发生了变化 即388位氨基酸由甘氨酸转变为精氨 酸 该位点位于FGFR4的高度保守序列中 2据报道 FGFR4Arg388基因型并不影响肿瘤的发生过程 因为在乳 腺癌患者及正常对照中 该SNP在两组中的分布比例大致相同 FGFR 4Arg388基因型均占50 左右 但在淋巴结阳性的乳腺癌患者中 FGFR4Arg388基因型与更短的无病 生存期和总生存期有关 14 有报道显示 携带有Arg388等位基因的肺癌患者肿瘤发病年龄更早 差的临床分期的比例更高 生存期更短 所以FGFR4Gly388Arg可 能预测肺癌的预后 15 这些发现强调了该SNP位点具有临床意义 这一推断已在头颈部癌 前列腺癌 肺癌等恶性肿瘤中得以证实 3 16 18 当然也有一些文献认为该SNP无预后价值 近来 一项随机的II期实验研究中 257例T2 4 N0 2 M0原发性乳腺癌患者接受了阿霉素和环磷酰胺 AC 或阿霉素和 培美曲唑 AP 序贯多西他赛 Doc 作为新辅助化疗 多因素分 析显示 FGFR4Arg388是AC Doc作为乳腺癌患者新辅助治疗方案病理性完全缓解的独立预后因素 19 Sugiyama等发现了MT1 MMP FGFR4这个复合物 其中FGFR4R388等位基因可通过减少溶酶体 对MT1 MMP的降解而增加对胶原蛋白的侵袭 通过siRNA下调MT1 MMP或FGFR4 R388均可阻止细胞侵袭和生长 20 近来一项meta分析显示 FGFR4Gly388Arg多态性与前列腺癌的进展 相关 可作为前列腺癌的进展的一个分子标记 21 在目前发现的20余种成纤维生长因子 FGF 中 能与FGFR4结合的 生长因子有FGF1 2 4 6 8 9 16 17 18和19 其中只有FGF19仅对FGFR4特异性结合 22 且无论有无 Klotho存在 FGF19均可与FGFR4结合而引起后续的生物学效应 23 FGFR4的激活是FGF19促进肝细胞增殖 诱导肝癌形成的机制 24 FGF R4在在结直肠癌中的研究甚少 故而本课题重点探讨了FGFR4的表达 对结直肠癌细胞株的生物学行为的影响及作用机制 本研究为了解FGFR4对结直肠癌细胞株生物学特性的影响 进行了体 外功能实验 通过慢病毒转染技术下调FGFR4的表达 然后进行了一 系列功能实验 包括增殖实验 克隆实验 侵袭实验 划痕实验 流式细胞仪检测细胞的凋亡和细胞周期的变化 western blot检测凋亡及细胞周期相关蛋白在干扰前后的变化 初步探讨FGF R4影响结直肠癌细胞株生物学行为的机制 1 International Agencyfor ResearchOn Cancer World HealthOrganization GLOBOCANxx Estimated CancerIncidence Mortality andPrevalence Worldwideinxx EB OL xx 12 5 2 Eswarakumar VP Lax I Schlessinger J Cellular signalingby fibroblast growth factor receptors Cytokine GrowthFactor Revxx 16 139 49 3 Wang J Stockton DW Ittmann M The fibroblast growth factor receptor 4Arg388allele isassociated withprostate cancerinitiation andprogression Clin Cancer Resxx 10 6169 78 4 Katoh M Geic alterationsof FGFreceptors an emergingfield inclinical cancerdiagnostics and therapeutics Expert RevAnticancer Therxx 10 1375 9 5 Jacquemier J Adelaide J Parc P et al Expression ofthe FGFR1gene inhuman breastcarcinomacells Int JCancer1994 59 373 86 Leung HY Gullick WJ Lemoine NR Expression andfunctional activityof fibroblastgrowth factorsand theirreceptors inhuman pancreatiancer Int JCancer1994 59 667 75 37 Takahashi A Sasaki H Kim SJ et al Identification ofreceptor genesin renalcell carcinomaassociated withangiogenesis bydifferential hybridizationtechnique Biochem BiophysRes Commun1999 257 855 9 8 Meijer D Sieuwerts AM Look MP et al Fibroblast growth factor receptor4predicts failureon tamoxifentherapy inpatients withrecurrent breast cancer Endocr RelatCancer xx 15 101 11 9 Milano A Dal LagoL Sotiriou C et al What cliniciansneed toknow aboutantioestrogen resistancein breast cancer therapy European Journal of Cancerxx 42 2692 705 10 Gowardhan B Douglas DA Mathers ME et al Evaluation ofthe fibroblastgrowth factorsystem asa potentialtarget fortherapy inhuman prostate cancer Br JCancer xx 92 320 7 11 Ho HK Pok S Streit S et al Fibroblast growthfactor receptor4regulates proliferation anti apoptosis andalpha fetoprotein secretionduring hepatocellularcarcinoma progressionand representsa potentialtarget fortherapeutic intervention J Hepatol xx 50 118 27 12 Streit S Mestel DS Schmidt M FGFR4Arg388allele correlateswith tumourthickness andFGFR4protein expressionwith survivalof melanomapatients Br JCancer xx 94 1879 86 13 Bange J Prechtl D Cheburkin Y et al Cancer progressionand tumorcell motilityare associated with theFGFR4Arg 388 allele Cancer Resxx 62 840 47 14 Thussbas C Nahrig J Streit S et al FGFR4Arg388allele isassociated withresistance toadjuvant therapyin primarybreastcancer J ClinOncolxx 24 3747 55 15 Spinola M Leoni V Pignatiello C et al Functional FGFR4Gly388Arg polymorphismpredicts prognosisin lungadenocarcinoma patients J ClinOncolxx 23 7307 11 16 Ma Z Tsuchiya N Yuasa T et al Polymorphisms offibroblastgrowthfactorreceptor4have associationwith thedevelopment ofprostate cancerand benignprostatic hyperplasiaandtheprogression ofprostate cancerin aJapanese population Int JCancerxx 123 2574 9 17 Falvella FS Frullanti E Galvan A et al FGFR4Gly388Arg polymorphismmay affectthe clinicalstage ofpatients withlung cancerby modulatingthe transcriptionalprofile ofnormal lung Int JCancerxx 124 2880 5 18 Tanuma J Izumo T Hirano M et al FGFR4polymorphism TP53mutation and theirbinations areprognostic factorsfor oralsquamous cellcarcinoma Oncol Repxx 23 739 44 19 Marm F Werft W Benner A et al FGFR4Arg388genotype isassociatedwithpathological pleteresponse toneoadjuvant chemotherapyfor primarybreastcancer Ann Oncolxx 21 1636 42 420 Sugiyama N Varjosalo M Meller P et al Fibroblast growthfactorreceptor4regulates tumorinvasion bycoupling fibroblastgrowthfactorsignaling toextracellular matrixdegradation CancerRes xx 70 7851 61 21 Xu B Tong N Chen SQ et al FGFR4Gly388Arg polymorphismcontributes toprostatecancerdevelopment andprogression A meta analysis of2618cases and2305controls BMC Cancerxx 1 84 22 Xie MH Holb I Deuel B Dowd P Huang A Vagts A Foster J Liang J Brush J Gu Q Hillan K Goddard A et al FGF 19 a novelfibroblastgrowthfactor withunique specificityfor FGFR4 Cytokine1999 11 729 35 23 Wu X Ge H Lemon B et al Selective activationof FGFR4by anFGF19variant doesnot improveglucose metabolismin ob ob mice Proceedings ofthe NationalAcademy ofSciences ofthe UnitedStates ofAmericaxx 106 1437984 24 Xinle Wu Hongfei Ge Bryan Lemon et al FGF19 induced HepatocyteProliferation IsMediated throughFGFR4Activation Journal ofbiological chemistryxx 285 5165 70 二 项目创新点 主要研究开发内容及目标 实施方案 技术关键 技术路线和技术经济指标等 二 项目创新点 主要研究开发内容及目标 实施方案 技术关键 技术路线和技术经济指标等 51 实施方案 1 设计4个FGFR4RNAi靶点构建到慢病毒载体 进而小量包装秤病 毒颗粒 然后感染SW620和HCT116结直肠癌 通过定量PCR和Western blot法检测FGFR4在mRNA和蛋白水平的表达 筛选出干扰效果最佳的 siRNA 进行大量包装 形成FGFR4siRNA稳定转染的细胞株 FGFR4 持续低表达 构建FGFR4过表达慢病毒载体 进而包装成病毒颗粒 然后感染结直肠癌细胞株 形成FGFR4过表达细胞株 FGFR4持续高 表达 以备后续功能实验 2 对FGFR4siRNA稳转细胞株和FGFR4过表达细胞株 分别以各自未行 处理的细胞株作为对照 进行一系列的体外功能实验 以评价FGFR4 的上调和下调对结直肠癌细胞生物学行为的影响 包括增殖实验 克隆实验 侵袭实验 凋亡实验及细胞周期的变化 同时在分子水 平进行Western blot检测 以显示不同处理后 细胞增殖 侵袭 凋亡及细胞周期 相关蛋白表达的变化 如MMP 2 p 27 CyclinD1及Bcl xl等 3 分别将FGFR4siRNA稳转细胞株 FGFR4过表达细胞株和相应的未处 理的结直肠癌细胞株皮下注射至裸小鼠 nu nu 背部 构建成裸小 鼠结直肠癌模型 接种6 8周后 观测不同处理组成瘤体积 大小等增殖指标的变化 对裸小 鼠结直肠癌组织行免疫组化检测 以了解不同处理组肿瘤细胞生物 学特性相关分子表达的变化 2 研究方法和研究手段1 标本结直肠癌细胞株HCT 116 SW 620 DLD 1 SW 116 LS47等均购自上海中科院细胞所或ATCC 按说明书培养 利用 DMEM培养基 Gibico美洲胎牛血清 100IU ml青霉素及100ug ml链 霉素等培养细胞 BALB c nu nu 裸小鼠拟购自中国科学院上海药物研究所 合格证编号沪动合 证字122号 日龄28 32天 体重16 20 饲养于SPF级环境中 用于FGFR4RNAi和过表达实验的慢病毒载体拟购自上海基凯公司 2 利用软件设计3 4个FGFR4RNAi靶点 构建到慢病毒载体上 进而包装成病毒颗粒 然后感染FGFR4高表达的结直肠癌细胞株 经RT PCR和Western blot验证干扰效率 制备成FGFR4RNAi稳转细胞株 同样 运用慢病毒载体构建FGFR4过表达结直肠癌细胞株 3 利用流式细胞仪 CCK 8及侵袭小室等对FGFR4RNAi稳转株和FGFR4过表达细胞株进行体外功 能实验 包括增殖实验 克隆实验 侵袭实验 凋亡实验及细胞周 期的变化 同时在分子水平进行Western blot检测结直肠癌生物特性相关分子表达的变化 4 将FGFR4RNAi稳转株 FGFR4过表达细胞株及相应的未感染细胞株 分别皮下注射入裸小鼠背部 构建成裸鼠结直肠癌模型 进行体内 实验 观测成瘤体积等细胞增殖指标 利用免疫组化技术检测FGFR4不同表 达的裸鼠结直肠癌模型相关分子表达的变化 3 技术路线见图一6图一有效靶点大量包装设计4个FGFR4基因RNAi靶 点构建到慢病毒载体载体小量包装慢病毒颗粒感染HCT 116 SW620结直肠癌细胞株FGFR4mRNA和蛋白质的表干扰效率满意FG FR4基因过表过表达载体小慢病毒颗粒感染结FGFR4mRNAqPCR和FGFR4 过表达基因功能研究成瘤的体积 大小等增值指标的评肿瘤组织MMP 2 p 27 CyclinD 1 BCL xlMMP 2 p 27 CyclinD 1 BCL xl增值 侵袭 凋亡 细胞周期变化等In vivoInvitro裸鼠结直肠癌模型的构建74 技术关键本课题关键技术 在于FGFR4RNAi慢病毒载体的构建及FGFR4RNAi稳转结直肠癌细胞株 的建立 FGFR4过表达慢病毒载体的构建及FGFR4过表达结直肠癌细 胞株的建立 FGFR4不同表达的裸小鼠结直肠癌模型的构建 一系列 体外功能实验 体内功能实验及相关分子检测 探讨FGFR4在结直肠 癌发生发展中的作用 三 实施本项目已具备的条件 说明已具备的试验手段 技术力量 前期科研基础情况 1 本课题申请人可独立进行的实验操作主要包括新鲜标本DNA和R NA的抽提和测定 RT PCR及real timePCR的操作和结果分析 免疫组化技术的操作和结果分析 细胞 培养技术 蛋白抽提 浓度测定 western blot检测靶分子蛋白表达及结果分析 siRNA瞬时转染技术及转染效 率测定 CCK 8法检测细胞增殖实验 流式细胞术的检测 细胞免疫荧光技术在实验室老师协助下完成 2 慢病毒构建RNAi载体及过表达载体 是一些非常成熟的技术 FGFR4RNAi稳转株和FGFR4过表达细胞株的建立可请上海吉凯公司协 助完成 而该公司为专业从事介导靶分子上调和下调病毒载体的制 备和包装 已和前期研究所在实验室有过多次成功合作先例 而构 建裸小鼠肿瘤模型亦是一项常用的研究技术 可请相关老师指导完 成 3 本课题在叶延伟老师的带领下进行 叶老师在复旦大学附属肿 瘤医院攻读肿瘤学博士学位 期间在复旦大学实验研究中心进行了 为期1年的博士课题实验部分的研究 独立完成了一系列实验操作 实验结果已经发表 硕博连读期间以第一作者发表SCI论著5篇 最高IF为5 131分 累计 IF达18分 分别发表于Cancer Cancer letters Annals ofsurgical oncology Journalofsurgical oncology digestive surgery 此外 以共同作者发表国内外论著10余篇 郑州大学附属第一医院重点实验室韩超老师给予实验技术方面的帮 助 韩老师是郑州大学的在职博士 实验技术精湛 经验丰富 4 郑州大学第一附属医院重点实验室实验设备齐全 各个实验 领域均有专业实验指导员 为该研究顺利实施提供了很好的平台 8 四 项目的预期经济 社会和环境效益FGFR4在结直肠癌中的研究很 少 而且不够深入 本课题利用慢病毒载体构建FGFR4RNAi稳转结直肠癌细胞株和FGFR4 过表达细胞株 分别下调和上调FGFR4分子的表达 进行一系列的体 内和体外功能实验 从而更全面 多角度地阐述FGFR4在结直肠癌发 生发展中的作用 为结直肠癌新的治疗靶点的筛选提供一些依据 目前国内外文献尚未见相关报道 五 项目实施的计划进度91 xx年年1月 xx年年6月1 结直肠癌细胞株的培养 包括HCT 116 SW620及其他常见结直肠癌细胞株 筛选出FGFR4高表达和低表 达结直肠癌细胞株 2 FGFR4RNAi慢病毒载体的构建与包装 结直肠癌细胞株SW 620 HCT116的感染 qPCR和western blot反复检测FGFR4RNAi慢病毒感染的效率 制备FGFR4RNAi稳转结 直肠癌细胞株 3 FGFR4过表达慢病毒载体的构建与包装 慢病毒颗粒感染FGFR4低 表达结直肠癌细胞株 制备FGFR4过表达结直肠癌细胞株 2 xx年年7月 xx年年12月1 以FGFR RNAi稳转结直肠癌细胞株 FGFR4过表达结直肠癌细胞株和各自的未 感染细胞株为研究对象 进行一系列的体外功能实验 2 利用CCK 8法进行增殖实验 克隆实验 transwell小室行侵袭实验 划痕实 验 流式细胞仪