荧光定量PCR技术原理、方法、数据分析详述ppt课件.ppt

不同样品核酸提取 扩增 荧光定量PCR完美解决方案 北京百泰克生物技术有限公司 北京市海淀区上地信息路15号 Fax 010 62951781Tel 010 629517816298345862979408 E mail info 1 不同样品核酸提取 扩增 荧光定量PCR完美解决方案 核酸提取攻略 北京百泰克生物技术有限公司 北京市海淀区上地信息路15号 2 不同样品RNA提取最适方法RNA纯度与质量考察RNA提取常见问题及解决方案常见样品DNA提取特殊样品DNA提取DNA分离纯化中常见问题分析 内容概要 3 样品 裂解液 上层溶液 液氮研磨或其他方法处理 抽提 细胞裂解 干燥溶解或洗脱 离心洗涤 酒精沉淀或介质吸附 RNA提取流程 4 沉淀法 异丙醇或乙醇介质吸附法 RNA提取常用方法 沉淀方法 5 异硫氰酸胍 苯酚法在变性剂异硫氰酸胍的作用下 细胞被裂解 同时核蛋白体上的蛋白变性 核酸释放 释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相 从而得以分离 有机溶剂抽提 沉淀 得到纯净RNA RNA提取常用方法 裂解方式 胍盐 巯基乙醇盐酸胍裂解样本 抑制RNase的活性 巯基乙醇变性蛋白 6 BioTeke的RNA提取试剂具有明显的优势 在经典试剂的基础上 不断升级 多款高品质的RNA提取试剂 Tripure Trizol RNApure Trizol法的升级产品 7 组织 细胞样品RNA提取 材料 小鼠肝脏组织 方法 BioTekeRNApure高纯总RNA快速提取试剂盒0 1g样品组织结果 图 小鼠肝脏组织RNA 1234 8 RNApure高纯总RNA快速提取试剂 123 图片说明 1BioTekeRNAclean2BioTekeTRIpure TRIzol法 3BioTekeRNApure离心柱型 注 本图实验材料为植物叶片 9 同一样品基因组DNA和RNA分提 原理 根据基因组DNA和RNA在硅基质膜上的结合条件不同 用两根离心吸附柱分别提取基因组DNA和RNA 10 特殊样品RNA提取 血液 图1全血样品溶解在TRIpureLSReagent试剂后的状态 图2泳道1与2 在 80度保存一个月后的提取结果 M泳道 标准的Hela细胞RNA 11 材料 松针 冬青 香蕉 木菠萝和杨树 方法 通用植物总RNA提取试剂盒 离心柱型 0 1g样品组织结果 得率 约35 40 g纯度 OD260 OD280 1 82 1 95 12345678910 图片说明 1 2杨树 3 4香蕉 5 6松针 7 8冬青 9 10木菠萝 多糖多酚植物样品RNA的提取 12345678910 试剂盒适用范围 水稻种子 小麦种子 玉米种子 高粱种子 拟南芥种子 大豆种子 苹果 葡萄 香蕉 棉花 龙眼 荔枝 各种草坪牧草植物 各种树木 各种花卉等绝大多数植物 12 图片说明 1 2DNA和大RNA 3 4MicroRNA 材料为小鼠肝脏组织 MicroRNA提取 1234 提取原理 传统方法 先提取总RNA然后跑胶回收或沉淀MicroRNA 新方法 通过裂解液裂解和酸酚分层后过柱两次 一次去除基因组DNA和大片段RNA 后一次吸附MicroRNA 然后漂洗收集 新方法特点 高效分离小RNA 同时分离总RNA可用于miRNA siRNA和snRNA的分析适用各种来源的样品提取时间短 约30分钟完成实验 13 生物大分子具有共轭双键 在260和280nm波长处有光吸收峰 纯度 紫外分光光度计测定所提总RNA在260nm和280nm波长处的光吸收 以A260 A280的比值来判断总RNA的纯度 质量 甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定 RNA纯度与质量考察 14 RNA提取常见问题及解决方案 RNA的降解OD260 OD280比值偏低电泳带型异常下游实验效果不佳 15 RNA的降解 新鲜细胞或组织 裂解液的质量外源RNase的污染裂解液的用量不足组织裂解不充分另外某些富含内源酶的样品 如脾脏 胸腺等 很难避免RNA的降解 建议在液氮条件下将组织碾碎 并且匀浆时使用更多裂解液 16 RNA的降解 冷冻样品 样品取材后应立即置于液氮中速冻 然后可以移至 70 冰箱保存 样品要相对小一点 先用液氮研磨 再加裂解液匀浆 样品与裂解液充分接触前避免融化 研磨用具必须预冷 研磨过程中及时补充液氮 17 RNA的保护 采集样品的保护 通常用液氮保存样品保护剂RNAfixer 样品浸泡其中可以在37 保存一天 25 一周 4 一个月 20 一年左右 环境中RNase的清除 DEPC处理各种实验器具RNAsafe对溶液中RNase进行清除 RNA酶喷雾清除剂 可对固体表面的RNase起到清除的作用 更大程度上避免RNase的污染 18 蛋白质污染 不要吸入中间层及有机相 加入氯仿后首先混匀 并且离心分层的离心力和时间要足够 减少起始样品量 确保裂解完全 彻底解决办法 重新抽提一次 再沉淀 溶解 苯酚残留 不要吸入中间层及有机相 加入氯仿后首先混匀 并且离心分层的离心力和时间要足够 解决办法 重新抽提一次 再沉淀 溶解 OD260 OD280比值偏低 19 OD260 OD280比值偏低 抽提试剂残留 确保洗涤时要彻底悬浮RNA 并且彻底去掉75 乙醇 解决办法 再沉淀一次后 溶解 设备限制 测定OD260及OD280数值时 要使OD260读数在0 10 0 50之间 此范围线性最好 用水稀释样品 测OD时 对照及样品稀释液请使用10mMTris pH7 5 用水作为稀释液将导致比值的降低 20 非变性电泳 上样量超过3 g 电压超过6V cm 电泳缓冲液陈旧 均可能导致28S和18S条带分不开 变性电泳条带变淡 EB与单链的结合能力要差一些 故同样的上样量 变性电泳比非变性电泳要淡一些 甲醛的质量不高 电泳条带异常 21 抽提试剂的残留75 乙醇洗涤样品中杂质的残留多糖等杂质 再次沉淀DNA污染使用RNase Free的DNaseI消化抽提RNA 下游实验效果不佳 RNA降解 22 不同样品基因组DNA提取 常见样品基因组DNA提取细胞 组织 细菌 血液基因DNA提取植物材料DNA提取特殊样品基因组DNA提取大量血液样品DNA提取环境微生物DNA提取临床样本DNA提取DNA分离纯化中的常见问题分析 23 基因组DNA提取流程 24 化学方法CTAB法 适用于植物材料等 是一种阳离子去污剂 溶解细胞膜 与核酸结合 在高盐下溶解释放DNA SDS法 适用于血液 细胞 动物组织 细菌 酵母等物理方法机械剪切 超声波破碎 研磨匀浆等 易造成DNA断裂 酶法蛋白酶KBioTeke基因组DNA提取系列试剂盒综合利用上述方法 基因组DNA提取流程 细胞裂解 25 特点 不需要使用有毒的氯仿 苯酚等试剂多次柱漂洗确保高纯度 长度可达30 50Kb 提取原理 组织 细胞 细菌 血液基因组DNA提取 26 玉米叶片基因组DNA提取 使用新型快速植物基因组DNA提取试剂盒 提取原理 植物材料基因组DNA提取 27 特殊样品基因组DNA提取 传统方法适用于所有材料基因组DNA的提取 比如大量血液 比如土壤 粪便中的微生物基因组DNA的提取 比如病毒及其他微量样品DNA的提取 NO 28 中量 大量血液基因组DNA提取 传统方法消化后 用酚 氯仿抽提 时间长 损害操作人员健康BioTeke创新不用蛋白酶消化不用酚 氯仿抽提结果 得率 约75 250 g 5mL血样纯度 OD260 OD280 1 87 1 95 5ml全血基因组DNA提取电泳结果 29 土壤 粪便微生物基因组DNA提取 其他品牌试剂盒存在缺点 采用玻璃珠或钢珠破碎 导致基因组断裂严重 必须购买破碎专用设备 增加使用成本 采用包括玻璃奶 离心吸附柱串联的纯化方式 导致DNA大量损失 得率很低 很难真实反映土壤微生物的多样性 BioTeke的技术创新 采用酶法破碎 保证基因组的完整性 用异丙醇沉淀DNA DNA无损失 30 临床样品基因组DNA提取 病毒基因组DNA提取酵母基因组DNA提取口腔拭子DNA提取微量样品DNA提取石蜡组织DNA提取头发DNA提取 31 一步法DNA提取扩增 原理 综合微量样品基因组DNA提取和高效的PCR扩增试剂 从毛发 石蜡组织等微量组织中高效提取足够浓度的DNA 然后进行PCR扩增 操作简单 方便 可对大量样品同时进行操作 32 保证基因组DNA的完整性和纯度提高DNA的洗脱效率DNA的储存 基因组DNA分离纯化中的注意事项 33 保证基因组DNA的完整性和纯度提高DNA的洗脱效率DNA的储存 基因组DNA分离纯化中的注意事项 简化操作步骤 缩短操作时间减少物理因素对DNA的降解 震荡 搅拌等减少化学物质对DNA的降解 操作多在pH4 10防止基因组DNA的生物降解 DNase 34 保证基因组DNA的完整性和纯度提高DNA的洗脱效率DNA的储存 基因组DNA分离纯化中的注意事项 洗脱液65度预热10分钟洗脱体积不小于30 L洗脱2次或者3次 35 保证基因组DNA的完整性和纯度提高DNA的洗脱效率DNA的储存 基因组DNA分离纯化中的注意事项 可长期储存于pH 7 0的ddH2O或TE不易制成干品储存分装低温保存 36 如何提高微量核酸提取或回收后的浓度 核酸助沉剂的应用微量吸附柱的应用 15 l洗脱体系质粒提取胶回收或PCR产物回收微量细胞 组织DNA RNA提取病毒DNA RNA提取微量临床样本DNA RNA提取 37 不同样品核酸提取 扩增 荧光定量PCR完美解决方案 Real timeqPCR攻略 北京百泰克生物技术有限公司 北京市海淀区上地信息路15号 38 RT PCR原理Real timeqPCR原理及应用Real timeqPCR成功关键Real timeqPCR数据分析Real timeqPCR常见问题及解决方案 主要内容 39 中心法则与RT PCR RNA DNA RT PCR 40 逆转录反应可以以随机引物 oligo dT 或基因特异性的引物 GSP 起始 提取RNA的质量会影响到RT的产量及cDNA的完整性 整个过程要求无RNA酶操作 反转录酶 RNA酶抑制剂都会对产物的质量造成一定的影响 反转录相关因素 41 SuperM MLV反转录酶高效的逆转录活性 且无RNaseH活性ThermoM MLV反转录酶高效的逆转录活性 且无RNaseH活性适合合成长片段的cDNA 有很强的模板兼容性 对高GC含量 75 以上 和结构复杂的模板效果显著在42 60 具有较好的热稳定性 42 OnestepRT PCR 模板 使用BioTeke公司的RNApure总RNA提取试剂盒提取的鸡肝脏组织RNA 目的片段 管家基因 Actin反应体系 反应程序 43 RT PCR相关产品 SuperM MLV反转录酶 10000u 198元SuperRTKitcDNA第一链合成试剂盒50次 特价490元SuperOne stepRT PCRKit一步法RT PCR试剂盒50次 特价880元Thermo系列产品买二赠一 ThermoM MLV反转录酶 10000u 580元ThermoRTKitcDNA第一链合成试剂盒50次 价格1200元ThermoOne stepRT PCRKit一步法RT PCR试剂盒50次 价格1400元 反转录酶及试剂盒系列产品讲座期间特价优惠 44 RT PCR原理Real timeqPCR原理及应用Real timeqPCR成功关键Real timeqPCR数据分析Real timeqPCR常见问题及解决方案 45 实时荧光定量PCR技术的应用 基因表达差异分析拷贝数分析SNP检测miRNA定量转基因成分定量分析临床诊断 疾病及药物研发等 46 Real timeqPCR原理 如何对初始模板定量荧光信号如何产生 47 Real TimeqPCR主要概念 48 Real TimeqPCR曲线的意义 扩增曲线 熔解曲线 图片为 首都医科大学演示实验结果材料 小鼠肝脏基因 actin 49 实时荧光定量PCR的化学原理包括探针类和非探针类两种 非探针类则是利用荧光染料 如SYBRGreenI 或者特殊设计的引物 如LUXPrimers 来指示扩增的增加 探针类 TaqMan探针和分子信标 是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加 后者由于增加了探针的识别步骤 特异性更高 但前者则简便易行 荧光染料和荧光探针 50 SYBRGreenI工作原理 SYBRGreenI是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料 与双链DNA结合后 其荧光大大增强 这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想 SYBRGreenI的最大吸收波长约为497nm 发射波长最大约为520nm 在PCR反应体系中 加入过量SYBR荧光染料 SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后 发射荧光信号 而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号 从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步 51 LUX lightuponextention 引物是利用荧光标记的引物实现定量的一项新技术 目标特异的引物对中的一个引物3 端用荧光报告基团标记 在没有单链模板的情况下 该引物自身配对 形成发夹结构 使荧光淬灭 在有目标片断的时候 引物与模板配对 发夹结构打开 产生特异的荧光信号 LUX引物工作原理 52 TaqMan探针工作原理 F Primer Primer DegradationofTaqManprobebyDNApolymerase Reporter Quencher Suppressionoffluorescence 53 分子信标 molecularbeacon 工作原理 分子信标 一种在靶DNA不存在时形成茎环结构的双标记寡核苷酸探针 在此发夹结构中 位于分子一端的荧光基团与分子另一端的淬灭基团紧紧靠近 分子信标的茎环结构中 环一般为15 30个核苷酸长 并与目标序列互补 茎一般5 7个核苷酸长 并相互配对形成茎的结构 荧光基团连接在茎臂的一端 而淬灭剂则连接于另一端 分子信标必须非常仔细的设计 以致于在复性温度下 模板不存在时形成茎环结构 模板存在时则与模板配对 与模板配对后 分子信标的构象改变使得荧光基团与淬灭剂分开 当荧光基团被激发时 它发出自身波长的光子 图5 54 荧光阈值 Threshold Ct Ct值是扩增DNA的量达到阈值时候的循环次数 55 Ct值与起始模板的关系研究表明 每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系 起始拷贝数越多 Ct值越小 利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线 其中横坐标代表起始拷贝数的对数 纵坐标代表Ct值 如图所示 因此 只要获得未知样品的Ct值 即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数 Ct值 56 Real timeqPCR流程 57 一步法和两步法优缺点比较 根据自己需求 选择合适的方法 58 RT PCR原理Real timeqPCR原理及应用Real timeqPCR成功关键Real timeqPCR数据分析Real timeqPCR常见问题及解决方案 59 Real timeqPCR成功因素 引物设计 3 末端尽量不是A 18 24bp 扩增产物80 150bp 设计在基因保守区内Taqman探针 尽量靠在上游引物 长度30 45bp Tm比引物高至少5 5 端不要是G G会有淬灭作用 影响定量RNA质量和定量比较好 2条主带可见 28s和18s 定量准确内标 housekeepinggene 正确选择18srRNA actin GAPDH等标准曲线的准确制作R2 0 99 60 反应体系 模板浓度不要太高 反转录最多1 g总RNA PCR一般1 L反转录产物 引物浓度一般100nM 1mM 根据kit要摸索最佳反应条件小心操作 每管或每孔都要换新枪头 不要连续用同一个枪头加样 即使是混合液 每个样品至少要做3个平行孔 每组实验最好有3个重复 做统计分析 Real timeqPCR成功因素 做real timeqRT PCR前 做个普通的PCR 检测您的反应条件 61 RT PCR原理Real timeqPCR原理及应用Real timeqPCR成功关键Real timeqPCR数据分析Real timeqPCR常见问题及解决方案 62 Real timeqPCR数据分析 基线 baseline 通常是3 15个循环的荧光信号同一次反应中针对不同的基因需单独设置基线阈值 threshold 自动设置是3 15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍手动设置 置于指数扩增期 刚好可以清楚地看到荧光信号明显增强 同一次反应中针对不同的基因可单独设置阈值 但对于同一个基因扩增一定要用同一个阈值 Ct值 与起始浓度的对数成线性关系分析定量时候一般取Ct 15 35 太大或者太小都会导致定量的不准确 63 统计分析方法 绝对定量 此方法是用一系列已知浓度的标准品制作标准曲线 在相同的条件下目的基因测得的荧光信号量同标准曲线进行比较 从而得到目的基因的量 该标准品可以是纯化的质粒DNA 体外转录的RNA 或者是体外合成的ssDNA 相对定量 通过与内参基因Ct值之间的相差来计算基因表达差异 一般是2 Ct 或者是考虑扩增效率的Pfaffl法 64 绝对定量 65 相对定量 MarisaL WongandJuanF Medrano BioTechniquesJuly2005 66 相对定量 67 实时检测 在对数扩增时期 而不是终点检测敏感性高需要样品少特异性高 Taqman 精确定量 Real timeqRT PCR优点 68 RT PCR原理Real timeqPCR原理及应用Real timeqPCR成功关键Real timeqPCR数据分析Real timeqPCR常见问题及解决方案 69 特异性重复性灵敏度其他问题 常见问题讨论 70 扩增的特异性 引物 Tm 重新设计引物 优化条件 Tm 71 重复性 判断实验优劣的重要指标 判断指标 主要为标准差 SD 和变异系数 CV 影响重复性的因素 PCR反应扩增的效率 优化实验条件 使反应体系达到最佳扩增效率 目的基因的初始浓度 使用初始浓度具有较高数量级的样本或作平行孔 标准曲线的影响 不少于5个稀释度的标准品 涵盖待测样本中目的基因量可能出现的全部浓度范围 理想的标准品应与样本具有高同源性 质粒DNA或是体外合成 转录的RNA 72 影响灵敏度的因素 反应体系中形成的引物二聚体的影响可以用水解探针代替SYBRGreenI 有文献报导使用水解探针的敏感性要比SYBRGreenI高出10倍 可以使用热启动办法或使用特殊处理的Taq酶要尽可能地优化引物设计如果反应体系中出现PCR的抑制因素 应适当将目的基因的浓度稀释后再进行扩增 注意避免室温混合各种试剂 并且在一经混合后立即开始进行扩增 循环数Mg2 的浓度 73 Q1 无Ct值 信号 出现 可能性不大 检测荧光信号的步骤有误 一般SG法采用72 延伸时采集 Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号 引物或探针降解 可通过PAGE电泳检测其完整性 模板量不足 对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起 模板降解 避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况 74 Q2 Ct值出现过晚 Ct 38 扩增效率低 反应条件不够优化 设计更好的引物或探针 改用三步法进行反应 适当降低退火温度 增加镁离子浓度等 PCR各种反应成分的降解或加样量的不足 PCR产物太长 一般采用80 150bp的产物长度 75 Q3 标准曲线的线性关系不佳 加样存在误差 使得标准品不呈梯度 标准品出现降解 应避免标准品反复冻融 或重新制备并稀释标准品 引物或探针不佳 重新设计更好的引物和探针模板中存在抑制物 或模板浓度过高 76 Q4 阴性对照也出现明显的起飞 反应mix或水被污染 引物二聚体的出现 用SG法在35cycles以后阴性出现起飞属正常情况 可配合熔解曲线进行分析 反应过程中探针的降解 用PAGE电泳对探针进行检测 ROX校正的问题 如果使用了 则可能是ROX的降解所造成 77 Q5 熔解曲线不止一个主峰 引物设计不够优化 应避免引物二聚体和发夹结构的出现 引物浓度不佳 适当降低引物的浓度 并注意上下游引物的浓度配比 镁离子浓度过高 适当降低镁离子浓度 或选择更合适的mix试剂盒 模板有基因组的污染 RNA提取过程中避免基因组DNA的引入 或通过引物设计避免非特异扩增 78 Q6 扩增效率低 反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解 反应条件不够优化 可适当降低退火温度或改为三步扩增法 反应体系中有PCR反应抑制物 一般是加入模板时所引入 应先把模板适度稀释 再加入反应体系中 减少抑制物的影响 79 Q7 同样的试剂在不同仪器上产生不