第十七章--化妆品的分析与检测

第十七章第十七章 化妆品的分析与检测化妆品的分析与检测 近几年 随着经济的高速发展和社会生活的现代化 接触化妆品的人群日 益增多 化妆品行业也获得了空前的发展 种类日趋繁多 成分日趋复杂 因 此化妆品对健康的影响就成为人们关注的焦点 一 评价化妆品的四大要素 一 评价化妆品的四大要素 安全性 安全性 指暴露与某一特定物质不存在可预见的危害的危险性 或仅存 在没有实际意义的可被忽视的危害 稳定性 稳定性 指的是物质在一定条件下分解的难易程度 使用性 使用性 就是使用这个化妆品会给你带来什么样的效果 比如美白 补 水 保湿 提亮等 有效性 有效性 是否满足人们的需求很需要的效果 二 化妆品的综合分析与评价 二 化妆品的综合分析与评价 感官及稳定检测感官及稳定检测 为提升感官评定的准确性 稳定产品使用 提高使用 检验准确率 特制定此流程 包括视觉 味觉 嗅觉 安全性评价 安全性评价 是指综合运用安全系统工程学的理论方法 对系统存在的 危险性进行定性和定量分析 确认系统发生危险的可能性及其严重程度 提出 必要的控制措施 以寻求最低的事故率 最小的事故损失和最优的安全效益 微生物检测 微生物检测 为了更具实用性 先进性 可读性 便于使用者和化妆品 行业从业人员参考 重金属检测 重金属检测 从环境污染方面所说的重金属 实际上主要是指汞 镉 铅 铬 砷等金属或类金属 也指具有一定毒性的一般重金属 如铜 锌 镍 钴 锡等 化妆品的主要品种 护护肤肤用用品品 乳化体系 洁洁肤肤用用品品 表面活性剂体系 第一节第一节 化妆品的感官及稳定性检测化妆品的感官及稳定性检测 一 化妆品的感官评价一 化妆品的感官评价 1 护肤用品的感官评价 护肤用品的感官评价是通过对其使用性能的测定来评价的 膏霜 乳液类 产品的性能评价主要包括以下几个内容 铺展性 铺展性 主要指产品在涂抹过程中是否容易铺展 是否容易起白条现象 渗透性渗透性 指护肤产品在使用过程中其中的油脂 活性成分是否容易渗透 进皮肤中 滋润性 滋润性 指护肤产品赋予皮肤的滋润感 油腻性油腻性 指护肤产品在使用中没有过度的油腻感 粘起感 粘起感 指用指头将膏体挑起时的难易程度及此时的膏体形状 直接使用感直接使用感 指膏体在使用时以上各性能指标的情况 后期使用性后期使用性 指膏体在使用 10 min 以后以上各性能的情况 2 洁肤用品及洗发产品的性能评价 洁肤用品及洗发产品的性能评价主要有以下几方面 分散性分散性 在使用过程中样品是否容易分散于皮肤 头发上 泡沫性 泡沫性 产品在使用中泡沫是否丰富 细腻且稳定 易冲洗程度 易冲洗程度 产品在使用后是否容易漂洗干净 紧绷性紧绷性 洁肤产品在使用后是否有明显的紧绷感 脱脂感脱脂感 产品使用后是否有过度脱脂现象 二 化妆品的稳定性检测二 化妆品的稳定性检测 表表 17 1 温度保管指标1 天2 天3 天1 周2 周1 月2 月3 月其他 气味 外观 粘度 50 1 月 Ph 气味 外观 粘度 40 3 月 Ph 气味 外观 粘度 粘度 10 40 4 月 Ph 气味 外观 粘度 5 3 月 Ph 气味 外观 粘度 25 3 月 Ph 1 外观考察 有无分层现象 气味有无变化 有无沉淀 膏体有无粗细变化 2 光照实验 3 试验当天硬度 粘度 备注 第二节第二节 化妆品的安全性评价化妆品的安全性评价 一 急性毒性试验一 急性毒性试验 急性毒性 常被称为半致死量 记做 LD50 是 FDA 规定化妆品及化妆品组 分的毒理指标之一 急性毒性试验 经口服或经皮肤渗透 一般可分为急性口 服毒性试验和急性皮肤毒性试验 LD50 系指当受动物经一次或 24 h 内多次摄 取大剂量化妆品或化妆品组分等试验物质后 因毒理反应而出现受试动物死亡 数目在 50 时的试物质量 mg 和受试物体重 kg 之比 即以 mg kg 表示 并注明试物液摄取的途径 受试动物的种类 产源 性别 体重等 美国 FDA 将其列为评价化妆品组分的依据指标 主要原因如下 肤用化妆品虽不属于口服之列 但由于擦用过后 可经皮肤渗透于体内 而中毒 唇部化妆品 因随食物而带入体内 被组织吸收进入血液循环 可导致 中毒 眼部化妆品 因流泪或淌汗 经脸部皮肤渗入体内 可产生毒理反应 婴幼儿误食化妆品 可导致中毒死亡 化妆品涉及面广 男女老少皆用 应用频率高 护肤 美容均不可少 尤其当今化妆品品种繁多 化妆品新原料亦层出不穷地升级换代 就需要 LD50 的评价数据 以利配制前的正确选用 确保使用者的安全 吗啡 1 50 mg kg 阿斯匹林 50 500 mg kg 甲醇 500 5000 mg kg 乙醇 5000 15000 mg kg 根据物质的半致死剂量 LD50 值 美国科学院把毒性物质危险划分为五个等级 0 无毒性 LD50 15 g kg 1 实际无毒性 5 g kg LD50 15 g kg 2 轻度毒性 0 5 g kg LD50 5 g kg 3 中度毒性 50 mg kg LD50 500 mg kg 4 高度毒性 LD50 50 mg kg 二 皮肤刺激性试验二 皮肤刺激性试验 化妆品皮肤刺激性试验指采 用动物 一般为家兔 试验的方法来评价化妆品 对人体皮肤刺 激性大小的试验 试验包括急性皮肤刺激和多次皮肤刺激两 部 分内容 具体做法是将受试样品一次剂量或多次剂量涂敷 于健康无破损的动物 皮肤上 观察产生的可逆性炎性症状 为化妆品对人体皮肤的安全性提供依据 其结论分为无刺激 性 轻刺激性等四个等级 皮肤刺激强度评价皮肤刺激强度评价 表表 17 2 强度 分值 强度 分值 无刺激性 0 0 0 4 中等刺激性 2 0 5 9 轻刺激性 0 5 1 9 强刺激性 6 0 8 0 表表 17 3 皮肤反应积分皮肤反应积分 无红斑 0 无水肿 0 勉强可见 1 勉强可见 1 明显红斑 2 皮肤隆起轮廓清晰 2 中等到严重红斑 3 水肿隆起约 1 mm 3 红 斑 形 成 紫红色红斑并有 焦痂形成 4 水 肿 形 成 水肿隆起超过 1 mm 范围扩大 4 三 眼刺激性试验三 眼刺激性试验 试验基本原则试验基本原则 1 受试样品以一次剂量滴入每只实验动物的一侧眼睛结膜囊内 以未作处 理的另一侧眼睛作为自身对照 2 在规定的时间间隔内 观察对动物眼睛的刺激和腐蚀作用程度并评分 以此评价受试样品对眼睛的刺激作用 观察时间应能足以评价刺激效应的可逆 性和不可逆性 观察时间最少 72 h 但一般不超过 21 d 3 当动物出现严重和持久的痛苦迹象时 以适当的方式将动物处死 4 强酸或强碱物质如 pH 2 或 pH 11 5 由于其可预见的腐蚀特性 不必 做本试验 5 已在皮肤试验中证实具有腐蚀或严重刺激毒性的物质不必进行眼刺激试 验 可以推测该物质对眼睛将会引起相似的严重结果 6 在充分并公认的体外试验结果中确定可能产生刺激性或腐蚀性的物质不 必进行体内试验 目的目的 检测外来化合物对实验动物眼和粘膜得原发性刺激和腐蚀作用的急性试 验 为人类眼和粘膜接触该受试物的潜在危害提供资料 实验动物 实验动物 首选成年白色家兔 如果使用其它的哺乳动物做试验 试验者应提供选择 的依据 应选择与人类皮肤 粘膜反应比较相近的动物 常用的动物有家兔 豚鼠 动物种属的选择应依据要观察的指标和模型的合理性 通常一个试验类 型选择一种动物进行评价 体重 2 3 kg 至少 3 只 如果受试样品的显著 效应是可预见的 可以考虑用一只动物 如果用一只动物试验得出的结果提示 受试样品有严重的刺激性和腐蚀性 则不必进行进一步的试验 如果结果相反 则至少需要 3 只家兔 有时 在增加动物的进一步试验中应该适当的阐明可疑 反应 试验前动物要在动物实验室环境中至少适应 3 d 时间 试验前 24 h 要对实验动物的两只眼睛进行常规检查 有眼睛刺激症状 角膜缺陷或结膜损 伤的动物不能用于试验 眼刺激性评价标准眼刺激性评价标准 表表 17 4 急性眼刺激积 分指数 1 A 0 1 最高数 眼刺激的平均指数 M 1 0 1 眼刺激个体指数 1 1 0 1 刺激强度 0 5 48 h 后为 0 无刺激性 5 15 48 h 后 5 轻刺激性 15 30 48 h 后 10 刺激性 30 60 7 d 后 20 6 6 动物 30 7 d 后 4 6 动物 10 中度刺激性 60 80 7 d 后 40 6 6 动物 60 7d 后 4 6 动物 30 中度到重度刺激性 80 110 重度刺激性 眼刺激性评价标准眼刺激性评价标准 表表 17 5 观察项目刺激反应判断 符号 分值 角膜浑浊 以最致密 部位为准 无浑浊 散在或弥漫浑浊 虹膜清晰可见 半透明区易分辨 虹膜模糊不清 出现灰色透明区 虹膜细节不清 瞳孔大小勉强 看清 角膜不透明 由于浑浊 虹膜无法辨认 0 1 2 3 4 虹膜 正常 褶皱明显加深 充血 肿胀 角膜周围轻度充血 瞳孔对光任有反应 出血 肉眼可见坏死 对光无反应 或出现其中 一种反应 0 1 2 结膜充血 指眼睑膜 球结膜部位 血管正常 血管充血呈鲜红色 血管充血呈深红色 血管不易分辨 弥漫性充血呈紫红色 0 1 2 3 水肿 无水肿 轻微水肿 包括瞬膜 明显水肿 伴有部分眼睑外翻 水肿至眼睑半闭合 水肿至眼睑超半闭合 0 1 2 3 4 分泌物 无分泌物 少量分泌物 分泌物使眼睑或睫毛潮湿或粘着 分泌物使整个眼区潮湿或粘着 0 1 2 3 四 过敏性试验四 过敏性试验 过敏性试验 皮肤变态反应试验 是以诱发过敏为目的的而进行的诱发 性投药 是以确认药物的诱发性效果和过敏性 实验动物多数为豚鼠 每组受 试验动物数为 10 25 只 试验配成 0 1 水溶液 从头部向尾部成对地做三次 皮内注射 经过一星期后 第 8d 用 2cm 4cm 滤纸涂以赋形剂配制的试验物质 将其贴于注射部位 持续 48h 做封闭试验 第三节 化妆品微生物检测第三节 化妆品微生物检测 一 化妆品中细菌总数的检测一 化妆品中细菌总数的检测 化妆品细菌总数测定 指对化妆品内容物单位质量 或体积 内所含细菌数 量的检测 通常以 1g 或 1ml 化妆品中所含活菌的数量表示 测定细菌总数可以 用来判明化妆品被细菌污染的程度 以及生产单位所用的原料 设备 工艺流 程及操作环境的卫生状况 是对化妆品进行卫生学评价的科学依据 国家标准 刘一每种化妆品的细菌总数都有具体要求 如优级品的润肤乳液中细菌总数应 控制在 5010 个 1g 之内 具体测定方法参见 GF3 7918 2 87 仪器设备仪器设备 1 培养箱 36 1 2 恒温水浴锅 46 1 3 天平 4 灭菌广口瓶或三角瓶 500ml 5 灭菌培养皿 皿底直径 9 0 6 灭菌吸管 1 0 10 1 7 灭菌小试管 8 玻璃珠 直径 5 9 均质机 10 灭菌刀 剪刀 镊子 11 酒精灯 培养基和试剂培养基和试剂 1 蛋白胨 10 g 2 琼脂 15 20 g 3 牛肉膏 3 g 4 蒸馏水 1000 mL 5 氯化钠 5 g 6 pH 7 2 7 4 7 营养琼脂培养基 制法 将除琼脂以外的各成分溶于蒸馏水中 用 15 的 NaOH 调节 pH 使之在 7 2 7 4 加入琼脂 于 121 下高压灭菌 15 min 2 生理盐水 成分 1 NaCl 0 9 g 2 蒸馏水 100 ml 制法 一般每种检样配制 250 ml 无菌生理盐水 称取 2 2 gNaCl 加入 250 ml 蒸馏水溶解 分装于 2 支大试管中 每支 9 ml 再量取 225 ml 装于 500 ml 广口 瓶或三角瓶中 并加入适量的玻璃珠 剩余的装入另 1 支试管中 包扎后于 121 下高压灭菌 15 min 3 75 的酒精棉球 实验步骤实验步骤 2 3 1m l 36 1 在无菌条件下 将 25 ml 或 25 g 检样剪碎 放入装有 225 ml 无菌生理盐 水和玻璃珠的 500 ml 广口瓶或三角瓶内 经充分振摇 形成 10 1 均匀稀释液 用 1 ml 的无菌吸管吸取 10 1 稀释液 1 ml 注入装有 9 ml 无菌生理盐水的试 管内 振摇混合均匀 即为 10 2 稀释液 再用此吸管吸取 10 1 稀释液各 1 ml 于 2 个培养皿内 另取 1 ml 的无菌吸管吸取 10 2 稀释液 1 ml 注入装有 9 ml 无菌生理盐水的试管内 振摇混合均匀 即为 10 3 稀释液 再用此吸管吸 取 10 2 稀释液各 1 ml 于 2 个培养皿内 采用相同的方法吸取 10 3 稀释液各 1 ml 于 2 个培养皿内 检样在 36 1 下 48 h 后营养琼脂培养基中细菌的菌落数 化妆品中微生物指标限值化妆品中微生物指标限值 表表 17 6 微生物指标限值备注 菌落总数 CFU g 小于等于 500 小于等于 1000 眼部化妆品 口唇化妆品和儿童化妆品以及其他 化妆品 霉菌和酵母菌总数 CFU g 小于等于 100 耐热大肠杆菌群 g不得检出 金黄色葡萄球菌 g不得检出 铜绿假单胞菌 g不得检出 二 二 化妆品中粪大肠菌群的检测化妆品中粪大肠菌群的检测 粪大肠菌群是生长于人体和温血动物肠道中的一组肠道细菌 随粪便排除 体外 约占粪便干重的 1 3 以上 故称为粪大肠菌群 受粪便污染污染的水 食品 化妆品和水壤等物质均含有大量的这类菌落 在化妆品中若检出有粪大 肠菌群 即表明该化妆品已经被粪便污染 这时一般该化妆品的菌落总数均很 高 被粪便污染的化妆品中可能有肠道致病菌存在 经消费者使用等途径进入 人体后 可引起肠道性疾病 故这种化妆品对消费者存在潜在的危险性 从对 化妆品微生物污染状况检测表明 有三种微生物 粪大肠菌群 铜绿假单胞菌 和金黄色葡萄球菌 容易引起化妆品的污染 其中以粪大肠杆菌群超标比列最容易引起化妆品的污染 其中以粪大肠杆菌群超标比列最 高 高 一 粪大肠菌群的生化特性 一 粪大肠菌群的生化特性 粪大肠菌群不是细胞学上的分类命名 而是根据卫生学方面的需要 设定 的一类与粪便污染有关的一组细菌 粪大肠菌群为一群需氧及兼性厌氧的菌落 呈革兰阴性反应 能在普通培养基上生长繁殖 其生化活动能力较强 能发酵 多种糖类 产酸产气 其特点是能较快发酵乳酸 粪大肠菌群在乳酸培养基中于 37 摄氏度下进行培养 在 24 h 内能使乳糖 发酵产酸 还有甲酸解氢酶进行甲酸分解 生成氢气和二氧化碳 产生大量气 体 这时 若加入伊红美蓝指示剂 分解乳糖所产生的酸 带阳电荷 与伊红 美蓝呈紫色且有金属光泽 故常用此特性来鉴定粪大肠菌群 将粪大肠菌群接 种于蛋白胨水培养基中 于 37 摄氏度培养 24 h 粪大肠菌群能分解培养基中蛋 白质的色氨酸 产生淀基质 吲哚 当与试剂 对二甲基氨基苄甲醛 作用后 形成红色化合物 玫瑰淀基质 玫瑰吲哚 此种反应在生化中称为吲哚反 应 二 检测步骤 二 检测步骤 1 发酵 产酸产气 试验 将试样液以无菌接种于双倍乳糖胆盐发酵管 其内放有倒置的小玻璃管 以收集气体 内 置 44 摄氏度培养皿中培养 24 48 h 由于乳糖胆盐培养基是一种具有选择作用的培养基 其中胆盐具有 抑制革兰阳性菌的作用 若观察到发酵管内不产酸 由酚酞指示剂指示 不产 生 则报告试样为粪大肠菌群阴性 未检出粪大肠菌群 检测结束 若发酵管 内产酸产气 则继续进行下列检测 2 鉴别培养 将产酸产气的发酵管内试样培养液接种到伊红美蓝琼基平 皿上 置 37 摄氏度培养 1824 h 同时将该培养液接种到蛋白胨水中 置于 44 摄氏度培养 24 3 验证试验 对所检出的细菌需要进一步验证其是否是粪大肠菌 验证方法 有以下三种 菌落观察 在上述平面培养基上 仔细观察菌落生长情况 大肠菌群在 伊红美蓝琼脂培养基上其典型菌落呈深红色 圆形 边缘整齐 表面光滑湿润 常有金属光泽 或呈紫黑色不带或略带金属光泽及粉色 中心较深的菌落 革兰染色 镜检 将以上典型的 或近似的 大肠菌落进行革兰染色 镜 检 若呈现阳性 紫色 反应 则报告未检出大肠菌群 靛基质试验 吲哚试验 在上述已培养好的蛋白胨水中滴入靛基质试 剂 对二甲基氨基苄甲醛 进行靛基质反应 若液面呈玫瑰红色 呈阳性反应 则报告粪大肠菌群呈阳性 检出 若液面任是棕黄色 则报告粪大肠菌群呈阴 性 未检出粪大肠菌群 综合分析以上所有测试结果 当发酵管内产酸产气 观察试验平面皿为典 型粪大肠菌落 并经革兰染色 镜检试验为阴性 及靛基质试验为阳性 则报告该试样液检出粪大肠菌群 三 三 绿脓杆菌的检测绿脓杆菌的检测 1 1 原理原理 绿脓杆菌 Pseudomonas aeruginosa 属于假单胞菌属 为革兰氏阴性杆菌 氧化酶阳性 能产生绿脓菌素 此外还能液化明胶 还原硝酸盐为亚硝酸盐 在 42 条件下能生长 该菌对人有致病力 可使伤处化脓 引起败血症等 2 2 仪器仪器 1 恒温培养箱 37 42 2 三角瓶 3 试管 4 平皿 5 刻度吸管 10 mL 2 mL 1 mL 6 显微镜 7 载玻片 8 接种针 接种环 9 电炉 10 高压灭茵器 3 3 培养基和试剂培养基和试剂 1 SCDLP 液体培养基 2 十六烷基三甲基溴化铵培养基 表表 17 7 成分 牛肉膏 3 g 蛋白胨 氯化钠 十六烷基三甲基溴化铵 琼脂 蒸馏水 10 g 5 g 0 3 g 20 g 1000 mL 制法 除琼脂外 将上述成分混合加热溶解 调 pH 为 7 4 7 6 加入琼 脂 68 95 kPa 10 1b 20 min 灭菌后 制成平板备用 3 乙酰胺培养基 表表 17 8 成分 乙酰胺 10 g 氯化钠 无水磷酸氢二钾 无水磷酸二氢钾 硫酸镁 MgSO4 7H2O 酚红 琼脂 蒸馏水 5 g 1 39 g 0 73 g 0 5 g 0 012 g 1 2 溶液 1 mL 20 g 1000 mL 制法 除琼脂和酚红外 将其它成分加到蒸馏水中 加热溶解 调 pH 为 7 2 加入琼脂 酚红 103 43 kPa 15 lb 20 min 高压灭菌后 制成平板备用 4 绿脓菌素测定用培养基 表表 17 9 成分 蛋白胨 20 g 氯化镁 硫酸钾 琼脂 甘油 化学纯 蒸馏水 1 4 g 10 g 18 g 10 g 1000 mL 制法 将蛋白胨 氯化镁和硫酸钾加到蒸馏水中 加温使其溶解 调 pH 至 7 4 加入琼脂和甘油 加热溶解 分装于试管内 68 95 kPa 10 lb 20 min 高压灭菌后 制成斜面备用 5 明胶培养基 表表 17 10 成分 牛肉膏 3 g 蛋白胨 明胶 蒸馏水 5 g 120 g 1000 mL 制法 取各成分加到蒸馏水中浸泡 20 min 随时搅拌加温使之溶解 调 pH 至 7 4 分装于试管内 经 68 95 kPa 10 lb 20 min 灭菌后 直立制成高层备 用 6 硝酸盐蛋白胨水培养基 表表 17 11 成分 蛋白胨 10 g 酵母浸膏 硝酸钾 亚硝酸钠 蒸馏水 3 g 2 g 0 5 g 1000 mL 制法 将蛋白胨和酵母浸膏加到蒸馏水中 加热使之溶解 调 pH 为 7 2 煮沸过滤后补足液量 加入硝酸钾和亚硝酸钠 溶解混匀 分装到加有小倒管 的试管中 68 95 kPa 10 lb 20 min 灭菌后备用 7 普通琼脂斜面培养基 表表 17 12 成分 蛋白胨 10 g 牛肉膏 氯化钠 琼脂 蒸馏水 3 g 5 g 15 g 1000 mL 制法 除琼脂外 将其余成分溶解于蒸馏水中 调 pH 为 7 2 7 4 加入 琼脂 加热溶解 分装试管 103 43 kPa 15 lb 20 min 高压灭菌后 制成斜 面备用 4 4 操作步骤操作步骤 1 增菌培养 取 1 10 样品稀释液 10 mL 加到 90 mL SCDLP 液体培养基 中 置 37 培养 18h 24 h 如有绿脓杆菌生长 培养液表面多有一层薄菌膜 培养液常呈黄绿色或蓝绿色 2 分离培养 从培养液的薄膜处挑取培养物 划线接种在十六烷基三甲 基溴化铵琼脂平板上 置 37 培养 18h 24 h 凡绿脓杆菌在此培养基上 其 菌落扁平无定型 向周边扩散或略有蔓延 表面湿润 菌落呈灰白色 菌落周 围培养基常扩散有水溶性色素 此培养基选择性强 大肠艾希氏菌不能生长 革兰氏阳性菌生长较差 在缺乏十六烷基三甲基溴化铵培养基时也可用乙酰胺 培养基进行分离 将菌液划线接种于平板上 放 37 培养 24 h 绿脓杆菌在 此培养基上生长良好 菌落扁平 边缘不整 菌落周围培养基略带粉红色 其 它菌不生长 3 染色镜检 挑取可疑的菌落 涂片 革兰氏染色 镜检为革兰氏阴性 者应进行氧化酶试验 4 氧化酶试验 取一小块洁净的白色滤纸片放在灭菌平皿内 用无菌玻 璃棒挑取绿脓杆菌可疑菌落涂在滤纸片上 然后在其上滴加一滴新配制的 1 二 甲基对苯二胺试液 在 15 s 30 s 之内 出现粉红色或紫红色时 为氧化酶试 验阳性 若培养物不变色 为氧化酶试验阴性 5 绿脓菌素试验 取可疑菌落 2 3 个 分别接种在绿脓菌素测定培养 基上 置 37 培养 24 h 加入氯仿 3 mL 5 mL 充分振荡使培养物中的绿 脓菌素溶解于氯仿液内 待氯仿提取液呈蓝色时 用吸管将氯仿移到另一试管 中并加入 1 mol L 的盐酸 1 mL 左右 振荡后 静置片刻 如上层盐酸液内出 现粉红色到紫红色时为阳性 表示被检物中有绿脓菌素存在 6 硝酸盐还原产气试验 挑取可疑的绿脓杆菌纯培养物 接种在硝酸盐 蛋白胨水培养基中 置 37 培养 24 h 观察结果 凡在硝酸盐蛋白胨水培养 基内的小倒管中有气体者 即为阳性 表明该菌能还原硝酸盐 并将亚硝酸盐 分解产生氮气 7 明胶液化试验 取绿脓杆菌可疑菌落的纯培养物 穿刺接种在明胶培 养基内 置 37 培养 24 h 取出放冰箱 10 min 30 min 如仍呈溶解状时即 为明胶液化试验阳性 如凝固不溶者为阴性 8 42 生长试验 挑取可疑的绿脓杆菌纯培养物 接种在普通琼脂斜面 培养基上 放在 41 42 培养箱中 培养 24 h 48 h 绿脓杆菌能生长 为 阳性 而近似的荧光假单胞菌则不能生长 5 5 检验结果报告检验结果报告 被检样品经增菌分离培养后 在分离平板上有典型或可疑菌落生长 经证 实为革兰氏阴性杆菌 氧化酶及绿脓菌素试验皆为阳性者 即可报告被检样品 中检出绿脓杆菌 如绿脓菌素试验阴性而液化明胶 硝酸盐还原产气和 42 生长试验三者皆为阳性时 仍可报告被检样品中检出绿脓杆菌 四 金黄色葡萄球菌的检测四 金黄色葡萄球菌的检测 1 1 定义定义 金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus 为革兰氏阳性球菌 呈葡萄状排 列 无芽胞 无荚膜 能分解甘露醇 血浆凝固酶阳性 该菌是葡萄球菌中对 人类致病力最强的一种 能引起人体局部化脓性病灶 严重时可导致败血症 2 2 仪器和设备仪器和设备 1 显微镜 2 恒温培养箱 3 离心机 4 刻度吸管 1 mL 5 mL 10 mL 5 试管 6 载玻片 7 酒精灯 3 3 培养基和试剂培养基和试剂 1 SCDLP 液体培养基 2 Baird Parker 氏培养基 表表 17 13 成分 胰蛋白胨 10 g 牛肉膏 酵母浸膏 丙酮酸钠 甘氨酸 氯化锂 LiCl 6H2O 琼脂 蒸馏水 5 g 1 g 10 g 12 g 5 g 20 g 950 mL pH 7 0 0 2 增菌剂的配制 30 卵黄盐水 50 mL 与除菌过滤的 1 亚碲酸钾溶液 10 mL 混合 保存于冰箱内 制法 将各成分加到蒸馏水中 加热煮沸完全溶解 校正 pH 分装每瓶 95 mL 103 43 kPa 高压灭菌 15 min 临用时加热溶化琼脂培养基 每 95 mL 加入预热至 50 的卵黄亚碲酸钾增菌剂 5 mL 摇匀后制成平板 培养基应是 致密不透明的 使用前在冰箱贮存不得超过 48 h 3 血琼脂培养基 表表 17 14 制法 将营养琼脂加热融化 待冷至 50 左右无菌操作加入脱纤维羊血 摇匀 制成平板 置冰箱内备用 4 甘露醇发酵培养基 表表 17 15 成分 蛋白胨 10 g 氯化钠 甘露醇 牛肉膏 0 2 麝香草酚蓝溶液 蒸馏水 5 g 10 g 5 g 12 mL 1000 mL 制法 将蛋白胨 氯化钠 牛肉膏加到蒸馏水中 加热溶解 调 pH 7 4 加入甘露醇和指示剂 混匀后分装试管中 68 95 kPa 10 lb 20 min 灭 菌备用 5 兔 人 血浆制备 取 3 8 柠檬酸钠溶液 103 43 kPa 15 lb 30 min 高压灭菌 1 份加 兔 人 全血 4 份 混匀静置 2000 rpm 3000 rpm 离心 3 min 5 min 血球 下沉 取上面血浆 6 无菌液体石蜡 4 4 操作步骤操作步骤 1 增菌 取 1 10 稀释的样品 10 mL 接种到 90 mL SCDLP 液体培养基 中 置 37 培养箱 培养 24 h 2 分离 自上述增菌培养液中 取 1 2 接种环 划线接种在 Baird Parker 平板 如无此培养基也可划线接种到血琼脂平板 置 37 培养 24 h 48 h 在血琼脂平板上菌落呈金黄色 大而突起 圆形 不透明 表面光滑 周围有溶血圈 在 Baird Parker 平板上为圆形 光滑 凸起 湿润 直径为 2 mm 3 mm 颜色呈灰色到黑色 边缘为淡色 周围为一混浊带 在其外层有 一透明带 用接种针接触菌落似有奶油树胶的软度 偶然会遇到非脂肪溶解的 类似菌落 但无混浊带及透明带 挑取单个菌落分纯在血琼脂平板上 置 37 培养 24 h 成分 营养琼脂 100 mL 脱纤维羊血 或兔血 10 mL 3 染色镜检 挑取分纯菌落 涂片 进行革兰氏染色 镜检 金黄色葡 萄球菌为革兰氏阳性菌 排列成葡萄状 无芽胞 无夹膜 致病性葡萄球菌 菌 体较小 直径约为0 5 m 1 m 4 甘露醇发酵试验 取上述分纯菌落接种到甘露醇发酵培养基中 在培 养基液面上加入 2 mm 3 mm 的灭菌液体石蜡 置 37 培养 24 h 金黄色 葡萄球菌应能发酵甘露醇产酸 5 血浆凝固酶试验 吸取 1 4 新鲜血浆 0 5 mL 放入灭菌小试管中 加入待检菌 24 h 肉汤培养物 0 5 mL 混匀 放 37 恒温箱或恒温水浴中 每半小时观察一次 6 h 之内如呈现凝块即为阳性 同时以已知血浆凝固酶阳 性和阴性菌株肉汤培养物及肉汤培养基各 0 5 mL 分别加入灭菌 1 4 血浆 0 5 mL 混匀 作为对照 5 5 检验结果报告检验结果报告 经增菌培养后 在分离平板上有典型或可疑菌落生长 经染色镜检 证明 为革兰氏阳性葡萄球菌 并能发酵甘露醇产酸 血浆凝固酶试验阳性者 可报 告被检样品检出金黄色葡萄球菌 五 霉菌和酵母菌的检测五 霉菌和酵母菌的检测 1 1 定义定义 霉菌和酵母菌总数是指化妆品检样在一定条件下培养后 1 g 或 1 mL 化 妆品中所污染的活的霉菌和酵母菌菌落总数 藉以判明化妆品被霉菌和酵母菌 污染程度及其一般卫生状况 本方法根据霉菌和酵母菌特有的形态和培养特性 在虎红培养基上 置 28 培养 72 h 计算所生长的霉菌和酵母菌数 2 2 仪器和设备仪器和设备 1 恒温霉菌培养箱 28 2 振荡器 3 天平 4 三角瓶 5 试管 6 试管架 7 平皿 直径 90 mm 8 刻度吸管 1 mL 2 mL 10 mL 9 量筒 10 酒精灯 11 高压灭菌器 3 3 培养基和试剂培养基和试剂 1 生理盐水 2 虎红 孟加拉红 培养基 表表 17 16 成分 蛋白胨 5 g 葡萄糖 磷酸二氢钾 硫酸镁 含 7H2O 琼脂 1 3000 虎红溶液 四氯四碘荧光素 蒸馏水 氯霉素 10 g 1 g 0 5 g 20 g 100 mL 1000 mL 100 mg 制法 将上述前 5 种成分加入蒸馏水中溶解后 再加 入虎红溶液 分装后 103 43 kPa 15 lb 20 min 高压灭菌 另用少量乙醇溶 解氯霉素 过滤除菌后 加入培养基中 若无氯霉素 可用链霉素代替 每 1000 mL 培养基加链霉素 30 mg 4 4 操作步骤操作步骤 1 样品稀释 见菌落总数测定中 6 1 2 取 1 10 的检液 2 mL 分别注入 2 个灭菌平皿内 每皿 1 mL 若菌量较 多时可顺序再做 10 倍稀释 另取 1 个灭菌空平皿 作空白对照 每皿分别注 入融化并冷至 45 左右的虎红培养基约 15 mL 充分摇匀 凝固后 翻转平 板 置 28 培养箱 培养 72 h 计数平板内生长的霉菌和酵母菌数 若有霉 菌蔓延生长 为避免影响其它霉菌和酵母菌的计数时 于 48 h 应及时将此平板 取出计数 3 计算方法 先点数每个平板上生长的霉菌和酵母菌菌落数 求出每个稀 释度的平均菌落数 判定结果时 应选取菌落数在 5 50 个范围之内的平皿计 数 乘以稀释倍数后 即为每 g 或每 mL 检样中所含的霉菌和酵母菌数 其它 范围内的菌落数报告应参照菌落总数的报告方法报告之 4 每 g 或每 mL 化妆品含霉菌和酵母菌数以 CFU g mL 表示 第四节 化妆品的重金属检测第四节 化妆品的重金属检测 一 砷的检测一 砷的检测 砷可以通过呼吸道 消化道及皮肤接触等进入人体 对人体造成危害 砷 化物进入人体后 可抑制硫基酶等而引起组织代谢紊乱 细胞死亡 对呼吸系 统 消化系统 血液系统 神经系统等都造成危害 还能引起恶性肿瘤 肺癌 皮肤癌等 且有致畸作用 有机砷主要是对中枢神经系统有损害 我国化妆品 卫生标准中规定其限量不大于 10 mg kg 测定化妆品中含砷量的方法有二乙基 硫代甲酸银比色法和砷斑法 一 原理一 原理 样品消化后 以碘化钾 氯化亚锡将高价砷还原为三价砷 然后与锌粒和 酸产生的新生态氢声称砷化氢 经银盐溶液吸收后 形成红色胶态物 与标准 系列比较定量 二 试剂与仪器二 试剂与仪器 1 砷的吸收 称取 0 25 克 DDC Ag 和 0 25 克奎宁 C20H24O2N2 溶于 100 毫升氯仿中静 置过夜 必要时过滤 澄清的吸收液应贮于棕色瓶中 奎宁的处理 一般奎宁 以盐类形式存在 如硫酸奎宁 将它溶于沸水中 加入 1N 氢氧化钠溶液使溶 液呈碱性 此时有大量奎宁析出 过滤 氯渣用水洗涤数次 然后溶于氯仿中 此氯仿液置于分液漏斗中 用水洗至水层呈中性 氯仿层用无水硫酸钠干燥后 蒸发氯仿 残氯仿液置于分液漏斗中 用水洗至水层呈中性 氯仿层用无水硫 酸钠干燥后 蒸发氯仿 残渣以少量丙酮处理之 即得到奎宁粉末 砷吸收液 中加奎宁的目的 是使吸收液呈碱性 能加速胶态银稳定的形成 其他如吡啶 也有类色作用 2 其他试剂的配制同古蔡氏砷班法 3 分光光度计 4 砷化氢吸收 三 操作方法 三 操作方法 1 样品处理 按古蔡砷斑法的样品处理 所得的灰分 加水 l0 毫升 1 1 H2S04溶液 10 毫 升 使残渣溶解 并过滤于 100 毫升容量瓶中 用水稀释至刻度 2 样品分析 吸取一定量样品溶液 视样品中含砷量而定 置于三角烧瓶中 另准确吸取每毫升相当于 1 微克砷的标准溶液 0 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 毫升 分别置于三角烧瓶中 在盛有样品溶液或标准溶液的三角烧瓶中各加入 水 60 毫升 l 1H2SO4溶液 15 毫升 15 碘化钾溶液 5 毫升 40 氯化亚锡溶 液 2 毫升 摇匀 放置 10 分钟后 加入锌粒 6 克 立即塞紧带有玻璃弯管的橡 皮塞 并将出口的尖管浸插在预先加有 5 毫升 吸收液的比色试管中 在室温下 25 左右 反应吸收 40 分钟 取下吸收管 用氯仿补足各管的吸收液的体积 至 5 毫升 用分光光度计于 500 nm 波长处测定光密度 根据各标准管读得的 光密度绘制标准曲线 根据样品溶液测得的光密度 从标准曲线中查得相应的 砷含量 计算 砷 mg kg C W 1000 C 相当于砷的标准量 mg W 测定时样品溶液相 当样品的重量 g 注 1 砷的反应吸收尽量控制在 25 左右进行 天热时测定 吸收管 应放在冰水中 避免吸收液挥发 2 使用无砷锌粒时 最好加人两颗颗粒较 大的锌粒 其余仍用细锌粒 如全部用细锌粒 反应太激烈 化妆品有害物质限值化妆品有害物质限值 表表 17 17 有害物质 限值 mg kg 备注 汞 1 含有机汞防腐眼部化妆品除外 铅 10 砷 2 镉 5 甲醇 200 二恶烷 30 石棉 不得检出 二 汞的检测二 汞的检测 汞及其无机物有机化合物都具有不同程度的毒性 都可以透过皮肤渗入人 体内 因此 化妆品中汞的含量受到各国的高度重视 FAO WHO 将汞排在优先研 究的有害金属的第四位 我国化妆品卫生标准中规定汞的限量为不得超过 1 mg kg 用于眼部化妆品的防腐剂硫柳汞除外 汞中毒主要是由汞离子引起的 汞离子与蛋白的巯基络合形成金属蛋白 从而抑制了酶的活性 使人体的肾 肝受到损害 无机盐可引起人体急性中毒 对肾脏损害最大 可引起尿蛋白 血尿等 严重的可引起尿毒症甚至死亡 化妆品中汞的含量一般很低 常用的 检测方法为测汞仪法 1 标准汞的配制 30 0 质量分数 氯化亚锡溶液 分析纯 加少量水 再加 2 ml 硫酸 使之溶解后 加水至 10 ml 5 mol l 混合酸 取 10 ml 硫酸 10 ml 硝酸 慢慢倒入 50 ml 水中 冷 却后加水至 100 ml 汞标准溶液 精确称取 0 1354 g 经过 105 干燥的氯化汞 分析纯 加入混合酸使之溶解后转移 100 ml 容量瓶中 并稀释至刻度线 摇匀 用时精 确吸取此溶液 1 00 ml 移到 100 ml 容量瓶中 加混合酸至刻度 摇匀 此溶 液汞 0 1 ug ml 2 标准曲线的绘制 精确移取汞标准溶液 0 00 空白 0 1 0 20 0 40 0 60 0 80 1 00 ml 分别置于 250 ml 锥形瓶中 各加 5 mol l 混合酸至 10 ml 然后倒入汞发生器内 进行样品测定 以汞含量为横 坐标 测汞仪表头读数为纵坐标 绘制标准曲线 3 测试方法