复旦大学免疫实验小鼠脾脏单个核细胞分离及细胞计数

小鼠脾脏单个核细胞分离及细胞计数小鼠脾脏单个核细胞分离及细胞计数 实验时间 实验时间 实验地点 实验地点 实验人 实验人 1 实验原理实验原理 小鼠脾脏位于上腹部左后侧 体积较大 长条形 属于外周免疫器官 外周血中淋巴细胞可经再循环驻如脾脏等外周免疫器官的特定区域 所以富含 各类免疫细胞 免疫细胞的分离 采用红细胞裂解法 是根据细胞对渗透压变化的敏感度 红细胞由于细胞结构较为简单 仅有细胞膜结构 对于膨胀的耐受能力较差 因此绝大部分就会涨破 受到破坏 是一种比较温和的去除红细胞最简便易行 的方法 2 实验材料 实验材料 1 健康小鼠 2 手术器械 剪刀 镊子 解剖板 3 70 乙醇 4 PBS 缓冲液 红细胞裂解液 ACK 5 0 2 台盼蓝 6 细胞计数板 计数器 7 离心机 8 显微镜 3 实验方法 实验方法 3 1 取小鼠脾脏取小鼠脾脏 将小鼠颈椎脱位处死 用酒精消毒 用剪刀剪开背部皮肤 再找到脾脏 用镊子夹出脾脏并剪除周围组织 3 2 制备单个核细胞悬液制备单个核细胞悬液 将取出的脾脏置于盛有 3mlPBS 缓冲液的平皿中 然后再置于尼龙指套中 用针芯轻轻碾压使得单个核细胞悬浮于平皿中 吸取平皿中细胞悬液置于刻度离心管 15ml 中 以 1500rpm 离心 10min 弃去上清液 加入 ASK 至 2 3ml 轻轻吹打混匀并放置 2min 以破坏红细 胞 然后加入 PBS 缓冲液至 10ml 以 1500rpm 离心 10min 弃去上清液 用 PBS 缓冲液定容至 2ml 吹打混匀即为小鼠脾脏单个核细胞 悬液 3 3 计算细胞浓度计算细胞浓度 稀释十倍 随机选取一个大方格计数 细胞计数为 324 个 计算细胞浓度为 324 104 10 3 24 107 ml 3 4 计算细胞活力计算细胞活力 在总计为 324 个细胞中计数 死亡细胞有 16 个 计算细胞活力为 324 16 324 100 95 1 在理论范围之内 4 实验结果实验结果 4 1 研磨脾脏得到细胞悬液研磨脾脏得到细胞悬液 本实验中将小鼠的脾脏放入尼龙指套内 置于少量 PBS 液中缓慢研磨 获 得细胞悬液 实验中 我们发现尼龙指套不能滤去所有结缔组织 操作中会有 结为絮状团块的结缔组织 这些结缔组织在离心后会和细胞绞缠在一起 去除 十分麻烦 而且会损失细胞 应该在离心之前尽早用吸管吹打后小心弃去 这 样损失的细胞比较少 造成较小的误差 研磨脾脏时的力度 时间 温度都会影响细胞的活性 所以应置于冰上快 速 轻柔地研磨 置于液体中避免干磨 我们在实验室室温下碾磨 造成细胞 破碎较多 影响最终实验结果 4 2 白细胞计数白细胞计数 在使用血球计数板时 遇到了镜下看不到计数板格子线的问题 起初 我们 小组能够在镜下观察到细胞 但是细胞清晰时无法找到计数板格子线 后来我 们意识到 这可能是因为充池后立即观察 细胞还悬浮在液体中 和方格线不 在同一个平面上 静置 2 分钟后再调焦观察 只能隐约看到方格线 在反复调 试中发现 减小光圈并降低光源亮度可以增加方格线的清晰度 另外 一定要 注意在充池前对计