基因诊断病原学

基因诊断 病原学中的原理及应用 by PBL 3,1、简介,2、原理,3、特点,4、应用,5、发展,6、局限,基因诊断 利用分子生物学技术， -从DNA/RNA水平检测基因的存在 -分析基因的结构变异和表达状态 -对疾病作出诊断,核酸分子杂交PCR扩增DNA序列测定DNA芯片技术,病原体（pathogens）,能引起疾病的微生物和寄生虫的统称。微生物占绝大多数，包括病毒、衣原体、立克次体、支原体、细菌、螺旋体和真菌；寄生虫主要有原虫和嚅虫。,什么是病原体基因诊断？,病原体的基因诊断：针对病原体自身特异性核酸（DNA或RNA）序列，通过分子杂交和基因扩增等手段，鉴定和发现这些外源性基因组、基因或基因片段在人体组织中的存在，从而证实病原体的感染。,2、原理,-分子生物学技术： 分子杂交：检测特定序列 PCR：扩增外源性DNA DNA测序-病原体检测方法,用已知核酸探针确定单链核酸碱基序列的技术。Southern 印记杂交Northern 印记杂交斑点杂交原位杂交,分子杂交（molecular hybridization）,在有核糖体的病原体中：rRNA数量DNA故直接测定核糖体RNA,PCR扩增,2. 不同菌种间高度可变区是鉴别证据可变区两端具有保守序列,3.根据此保守序列，设计广谱PCR引物扩增的片段，对高变区扩增,primer1,primer2,4. 引物扩增的片段经测序，并与基因库中序列比较就可得出待测细菌的菌种,一些病原体检测方法(一)直接显微镜检查,(二)病原体分离、培养和鉴定,局限：适用于无菌，灵敏度低，分辨率低，耗时,局限：适用于易培养的微生物，耗时,(三)病原体抗原检测,抗体,抗体,S,局限：昂贵，存在正常菌时的交叉反应需对照,(四)病原体抗体检测,抗原,抗体,抗原,抗体,S,局限：敏感性（阴性值）特异性（阳性值）难定,主要技术为PCR -高度特异性 -高度敏感性 -快速检测已知DNA序列的 病原微生物发展而来DNA芯片技术用于微生物的侦查检测，对病原体分类和分型。,3、特点,分离培养周期长，操作繁杂，制约因素多 eg: 结核分枝杆菌 (1)培养：12个月 有合适引物，PCR检测、测序：= 同种细菌：= 【J clin Miicrobiol，2003.41（9】2-对PCR产物进行限制性片段长度多态性分析（RFLP） 建立了14种临床常见病原菌菌株特有的酶切图谱 中华实用诊断与治疗杂志，2009,23(12)3-对扩增产物进行变性梯度凝胶电泳/温度梯度凝胶电泳分析，直 接观察其多样性 Goldenberg等人还在此基础上建立了DHPLC技术 【JDis，2008，9（4）：19018; Microbiology，1996，142（Pt1）：31】,5、发展,封闭式、自动化、定量化,又分为蛋白芯片、基因芯片及其他类高通量微型化自动化用于微生物的侦查检测，分类和分型,生物芯片,O O O O O O O O O O O O O O O O,chip carries lots of identical probes,sample,Hybrideach probe,O O O O O O O O O O O O O O O O,O O O O O O O O O O O O O O O O,HIV基因芯片检测传统方法：免疫法-血清HIV抗体初筛、Western印迹法确证-可能存在的非特异性假阳性反应，常需进行2次、甚至3次血清学测定 原因：病毒多亚型，抗体结合有交叉免疫,-对某些病原体而言, 基因诊断的特异性问题尚未完全解决;-细菌对药物的敏感度测试问题目前还不能完全用基因诊断法来解决;-某种病原体的毒性, 如病毒的细胞毒性测定也不能用基因诊断法完成;-病原体的形态学研究更是不能为基因诊断取代-不能得知病原体进入体内后机体的反应,6、局限,小组成员及分工（根据拼音首字母顺序） 阅读文献、提出问题、制定学习计划： 彭文贝、张俊 查阅资料、解决问题： 兰佳佳、汪珉杰、张寒珂 制作展示幻灯： 乐可浩、朱佳异 演讲展示学习成果： 唐露主要参考文献： 【1】临床病原微生物快速诊断技术进展 吕游1综述王辉2 姜可伟1，王杉”、审校 国际检验医学杂志2013年4月第34卷第7期 【2】16SrRNA基因及16S23SrRNA基因间区在微生物鉴定中的应用 王艳萍综述夏云审校 国际检验医学杂志2013年4月第34卷第8期 【3】基因诊断方法的研究与进展 常 虹Journal of Clinical Rehabilitati