动物组织培养

,第三章,动物组织培养,目录 3.1动物组织培养的基本概念 3.2动物组织培养的技术 3.3动物组织培养的技术应用 3.4动物组织培养的进展,动物细胞特点: 无细胞壁倍增时间长，生长缓慢需氧量少，对搅拌敏感聚集体形成原代细胞培养50代即开始退化,3.1动物组织培养的基本概念,定义：,从动物体内提出组织，于模拟体内生理环境等特定的体外条件下，进行孵育培养，使之生存并生长。,分类：,器官培养,组织培养,细胞培养,开始：1907，Harrison用蝌蚪的髓管放于一滴淋巴液内，培养出神经元,成熟：以人的肿瘤组织为材料建立的各种细胞系，如Hela细胞系。,研究内容：细胞内代谢活动，外界对其影响，细胞间互相作用等。,历史,细胞融合现象的发现 19世纪30年代，Muller等相继在肺结核、天花、水痘、麻疹等病理组织中观察到多核细胞现象；1849年Lobing在骨髓中也发现了多核现象的存在；1855年1858年，科学家们在肺组织和各种正常组织及发尖和坏死部位都发现了多核细胞；1859年，A.Barli在研究黏虫的生活史时发现，某些黏虫存在着由单个细胞核融合形成多核的原生质团的情况。据此，他认为多核细胞是由单个细胞彼此融合而形成的。至此，自然界中广泛存在着多核细胞的事实，才被生命科学工作者接受。,动物细胞培养技术的建立1907年，Harrison首先培养了蛙胚神经管区细胞，并观察到从中长出的轴突细胞（神经纤维），他的工作被认为是动物细胞培养开始的标志；1911年，Carrel发现了鸡胚浸出液对于培养细胞的生长促进作用，并首次把无菌技术引入组织培养技术中。1914年，Thomson建立了器官培养技术。1940年，1951年，Earle和Gay分别建立了c3H小鼠结缔组织细胞系的L系和人体细胞系人体宫颈癌Hela细胞系。,A.Carrel,细胞融合技术的建立和杂交瘤技术的诞生 1958年, Okada发现紫外灭活仙台病毒可引起艾氏腹水瘤细胞彼此融合。60年代，Harris(1965)诱导不同动物体细胞融合获得成功并培养存活。Lifflefield(1964)根据亲本细胞的酶缺陷型，利用HAT选择性培养基能使亲本细胞死亡而只留下异型融合细胞，并能不断地增殖，从此形成了细胞融合到杂种细胞选择、培养的一整套技术。1975年，免疫学家Kohler和Milstein利用仙台病毒诱导绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，选择到能分泌单一抗体的杂种细胞。该杂种细胞具有在小鼠体内和体外培养条件下大量繁殖的能力，并能长期地分泌单克隆抗体，从而建立了小鼠淋巴细胞杂交瘤技术。,动物克隆技术的建立 首例克隆动物成功的报道是在1962年，英国学者Grudon把非洲爪蟾小肠上皮细胞的核注入同种或异种非洲爪蟾未受精卵(经紫外线照射杀死卵细胞核)中，约有1的重组卵发育成为成熟蛙。这一成功开创了由体细胞培育动物个体的新型实验途径，其贡献在于：实验证明了完全分化的肠细胞仍然具有未分化细胞的全部遗传信息，并能在一定的条件下发育成动物个体，从而证明了动物细胞仍然具有全能性；初步建立了体细胞核移植的实验体系，证明在体细胞核转至胚胎发育方向的早期，卵细胞质对体细胞核的发育功能起着关键性的调节作用，其作用因子可能是细胞质中的mRNA与有关的蛋白质。,动物细胞培养的优点,理化环境可控制。,细胞经培养后形成的细胞系和细胞株，特征均一。,培养物可直接被观测。,提供大量均一的细胞供制备用。,便于进行人工筛选。,结合电影技术，可观察细胞代谢活动和反应。,广泛应用于病毒学，免疫学，遗传学，肿瘤学，分化及发育，细胞毒理试验，生物技术等各个领域。,3.11培养细胞的特性,根据形态特征分类 贴壁型 上皮细胞型、 成纤维细胞型、 游走细胞型、 多形细胞形。 悬浮型 悬浮在溶液中,两种贴壁的培养细胞,细胞贴壁过程,接触抑制,定义：细胞从接种到长满底物表面后，由于细胞繁殖数量增多相互接触后，不再增加。,培养细胞一代生长过程,1）游离期 2）指数生长期 3）稳定期 4）衰退期,培养细胞的生存环境,1.环境无毒和无菌； 2.适宜的温度；人和哺乳动物培养细胞最适温度均为3537。 3.气体环境和氢离子浓度；需要一定量的O2（19959975pa）和CO2（95空气+5%CO2）；pH7.2-7.4 4.渗透压；260320mOsm/kg适用于大多数细胞 5.营养物质；六碳糖是主要的能源物质，还需要12种基本氨基酸和谷胺酰胺等,培养群体细胞的生命期,贴壁细胞原代培养,定义：从新鲜供体取得组织细胞后在体外进行首次培养，一般持续14周。 将分离所得的细胞沉淀，按实验要求，用培养液配制成需要浓度的细胞悬液，接种培养瓶内，水平放置，37度，进行培养，12天换液一次，大部可见细胞贴壁生长。,贴壁细胞传代培养,定义：当原代培养的细胞相互汇合时，细胞由原培养瓶消化、收集、稀释后传到新的培养瓶的过程。 注意： 如细胞没有生长到足以覆盖瓶底时，一般不要传代。 原代细胞类型不一，利用不同的消化时间和消化液。,细胞系（株）的建立,细胞系：原代细胞经第一次传代后，形成的细胞群体，即具有增殖能力，类型均匀的培养细胞，一般为有限细胞系。 细胞株：细胞系经过克隆或其他方法而得的单一类型的细胞群体。 原代培养后得到细胞系，再经多次传代培养后，一部分细胞死亡，一部分细胞继续生长并转化为连续细胞系或无限细胞系。 转化时间和细胞类型与培养条件和培养方法有关,CO2培养箱,纯化水装置,金属器材,辅助器材,加样器 支架 离心管 冷冻管,清洗和消毒过程,过滤除菌消毒,血清、合成培养液、酶液等含有蛋白质，具有生物活性，不能采用高温、高压消毒的方法进行灭菌，因此须采用过滤除菌,Zeiss滤器：中间夹石棉的一次性纤维滤板，可承受一定压力，是过滤血清等粘稠液体的滤器。,玻璃滤器：以烧结玻璃为滤板，固定在一玻璃漏斗上，用于过滤除血清等粘稠液体以外的各种培养液体,微孔滤膜滤器：中为混合纤维素滤膜，又可分为加压式和抽滤式。,过滤器,3.12 培养液的组成成分,氨基酸：十二种氨基酸必需，谷氨酰铵，谷氨酸等,盐类：钠离子，钾离子，镁离子，钙离子，氯离子，硫酸根离子，磷酸根离子，碳酸氢根离子等,葡萄糖：供能,缓冲系统：CO2缓冲系统或HEPES,生长因子：PDGF，EGF，FGF等,其它成分：维生素，矿物，有机补充物，激素等,平衡盐溶液（BSS）,功效：维持渗透压提供缓冲系统提供水分和无机盐,要求：和培养物来源的动物血清相似等渗,天然培养基,血清：提供营养和生长因子，促进细胞生长繁殖，粘附及中和有毒物质,血浆：支持培养组织块及供给细胞生长的营养物质，现在不常用,组织浸出液：可用鸡胚胎浸出液，含大分子核蛋白质和小分子氨基酸，能促进细胞生长,水解乳蛋白：氨基酸含量高，由乳白蛋白质经水解得到淡黄色粉末，一般可配制成0.5%溶液。,人工合成培养基,人工合成培养基：化学成分明确的培养基，便于重复和标准化管理和控制。,基本成分：氨基酸，维生素，糖，无机离子等,常用培养液：199培养液，Eagle培养液，RPMI1640培养液等,三种常用培养基配方,其它常用液,消化液：胰蛋白酶、二乙烯四乙酸二钠（EDTA）及胶原酶溶液 HEPES氢离子缓冲剂：调节pH值 NaHCO3溶液：调节pH值 NaHCO3+H2ONa+HCO3 +H2ONaH2CO3OH- Na+OH-+H2O+CO2 抗生素液：防止污染台盼蓝,注意,每一个细胞系都要进行大量，费力，费时的工作后，才能找到适当的培养液配方，对正常细胞，转化细胞，原代培养，建株培养，悬液培养等所选用的培养液、培养方法可能不同。,在开始培养细胞前，应查找有关文献。,3.2 动物组织培养技术,防止污染、无菌操作是动物组织培养成功的关键！,1）培养前准备：制定实验计划和操作程序。 2）超净台要用75%酒精擦洗，然后紫外线消毒30分钟，工作台面上用品不要过多或重叠放置。 3）个人进入无菌培养室原则上须彻底洗手并按外科手术要求着装，开始操作前要用75%酒精或0.2%新洁而灭消毒手和前臂。 4）实验中需保持无菌操作要求。实验前要点燃酒精灯，烧过的器械要注意冷却，以防细胞损伤。 5）分别使用不同吸管吸取营养液、PBS、细胞悬液及其它各种用液，而不能混用 6）不要用手触及已消毒的器皿，如已接触，要用火焰灼烧或取备用品更换。 7）注意操作时勿大声讲话或咳嗽。,取材,1)理论上讲，各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养。 2）幼体较成体、分化程度低的较分化程度高的、肿瘤组织较正常组织容易培养 3）组织取材应先切成1cm3的小块，可置于培养液中4度保存，不易超过24小时。 4）取材时避免污染及化学物质的损伤。,皮肤取材,1）皮肤细胞培养的来源 2）方法类似断层皮片手术的操作，面积为23mm2 3）不用碘酒消毒，但要严格灭菌消毒，必要时使用抗菌素。,血细胞取材,1）静脉取血 2）指尖或耳垂取血 3）用肝素抗凝剂20u/ml 4）抽血严格无菌,取鼠胚,1）用引颈法杀死动物2）浸入75酒精中5分钟消毒 3）开腹取材,取鸡胚,1）选新鲜受精鸡蛋，37度孵育912天，每天翻动鸡蛋一次。 2）无菌条件下，将鸡卵置于一个小烧杯中，令气室端向上，用碘酒消毒卵壳，再用酒精消毒。 3）用弯剪刀环行剪除气室端卵壳，切开卵膜，暴露出鸡胚。 4）用弯头钝玻璃棒伸入鸡胚头体之间下方，取出鸡胚。,组织块分离,切割分离组织法 用剪刀剪至1mm3左右的大小的块。,机械解离分离法,某些软组织如脑、胚胎和一些肿瘤等,消化分解法,胰蛋白酶法 适用消化细胞间质较少的软组织，如胚胎组织、羊膜、上皮、肝、肾等 钙离子、镁离子、血清等都对其有抑制作用。,胶原酶解细胞法,结缔组织复合胶原，用胶原酶解，使胶原酶最终浓度为200u/ml，36.5，静置448小时，上面悬液经离心获得或纤维细胞沉淀。,EDTA法,二乙烯四乙酸二钠，非酶性消化物 用于消化分离传代细胞，能螯合钙离子，镁离子， EDTA工作液用不含钙离子和镁离子的BSS配制成0.02%的浓度 通常和0.25的胰蛋白酶1：1合用,细胞悬液的分离方法,材料为血液、羊水、胸水和腹水等细胞悬液时，可以采用离心法分离细胞。 一般多用5001000rmp，510分钟。,培养细胞的纯化,自然纯化：靠自然的增殖能力，留下优势细胞，去除其他，达到纯化目的，如恶性肿瘤细胞 酶消化法：上皮细胞与成纤维细胞对胰蛋白酶的耐受性不同，成纤维细胞会先被消化 机械划除法：用机械外力划除混杂分区呈片的不需要细胞 反复贴壁法：根据不同细胞贴壁的速度不同。 克隆法，培养基限定法，流式细胞分离法等,3.21采用的一些培养方法,悬滴培养法 培养瓶培养法 旋转管培养法 灌注小室培养法 悬浮培养法 载体和生物反应器,1、悬滴培养法,单盖玻片悬滴培养法,将培养液滴于盖玻片上并铺展开,将待培养的组织块铺展于培养液中央,将盖玻片翻转放于凹载玻片上，密封,贴壁24小时内，细胞就能从组织块四周游走,适用于组织量少的原代培养,单盖玻片的再培养,1）用消毒剃须刀刮去盖玻片四周的石蜡 2）用镊子小心揭开盖玻片，培养物面朝上，放入培养皿内。 3）用白内障刀切除生长晕周围部分，留下方形培养物，并切成小块。 4）将小块在含有平衡盐溶液的培养皿中再漂洗，移入另一含有平衡盐溶液的培养皿内，进行再培养。,双盖玻片悬滴培养法,方法和前面基本相同。不同点：取一载体盖玻片，在其上滴一滴大小适当的消毒蒸馏水。将带有组织块的盖玻片的无组织一面贴到载体盖玻片上，借助水滴的扩展，将两张盖玻片贴牢在一起。 培养两天后，将带有培养物的盖玻片取下，漂洗后将其贴于一张新的载体盖玻片上，继续培养。 优点：1）容易换片。2）培养物在培养过程中，不需移动位置，有利于组织分化。,2.培养瓶原代培养,器材：培养瓶,材料：组织块或单层细胞,方法：单层细胞用消化培养法，将组织消化成为细胞悬液后培养,组织块以间距0.5cm均匀摆置在瓶壁上，翻转瓶，注入适宜培养液，37恒温24小时，待贴附后，再翻转平放，静置培养。,培养瓶传代培养,3.旋转管培养法,器材：旋转管，旋转瓶,由于旋转作用，组织块和细胞交替地与培养基和空气直接接触。,4.灌注小室培养法,基于悬滴培养建立的方法，可用来连续观察的细胞的动态变化,5.器官培养,从供体取得器官或器官组织块后，不进行组织分离而直接在体外的一定的环境中培养。,主要强调器官组织的相对完整性。,组织厚度和直径1mm，使之能靠自然渗透来维持氧气和营养。,保证内部细胞有足够的氧气渗入，可以提高氧分压或加注纯氧。,附加特殊的培养基如生长因子，激素,6.培养板培养法,具体做法是将培养细胞接种在培养板的孔内，然后在CO2培养箱内培养。最常用的培养板有6孔、24孔和96孔培养板，后者最为常用。一般都是一次性使用。,3.22单细胞分离培养,定义：又称为细胞克隆，即把一个单细胞从一个群体中分离出来单独培养，使之重新繁衍成为一个新的细胞群体的培养技术。 初代细胞具有异质性，经过细胞克隆后，后代细胞群来源于一个共同的祖细胞，即形成纯系，细胞株。 无限细胞系、转化细胞和肿瘤细胞等对培养环境有较大的适应性和具有较强独立生存能力的细胞，容易做出克隆。,1）将细胞制成细胞悬液 2）接种培养后让细胞分散在底物上，适应性大的和活力好的细胞能增殖形成细胞小群克隆。 细胞群中单个细胞形成的克隆的百分数称为克隆形成率或接种率，用来表示细胞生活力和独立生长能力。,培养方法,提高克隆形成率的措施,培养基：最好使用适应性培养基，即不含细胞而被细胞生活过的培养基。,利用饲养细胞,饲细胞：即滋养细胞，一层经过特殊处理的用做克隆细胞底物的细胞层。 制备过程过程如下：,其它,血清：以胎牛血清最好，应先做克隆形成率试验。 激素：110国际单位/ml营养液的胰岛素能促进细胞克隆的形成。 CO2：多用5的浓度。 底物特殊处理：可用多聚右旋赖氨酸处理培养瓶皿底物或5ug/ml的纤维连结素处理。 适应性底物：初代培养细胞易贴于胶原层或血浆纤维蛋白层底物上。或用2的琼脂层作为底物。,多孔塑料板克隆细胞法,1）将均匀的10个/ml的细胞悬液向多孔板的孔内加入0.15ml。2）置于CO2温箱内培养，注意保持湿度95。 3）适时、适量换液。 4）当孔内细胞增到500600个时，可以进行分离培养。,3.23培养细胞的生物学测定,由于体内和体外环境不同，培养细胞的生物特性有所不同。在培养细胞期间，要对细胞进行常规性检测。 细胞形态、细胞生长状况、营养液、微生物污染等方面进行检查。,细胞形态,在细胞机能不良时，轮廓增强，胞质中常出现空泡、脂滴和其它克力状物，细胞之间空隙加大，细胞形态可以变得不规则甚至失去原有特点，如上皮细胞变成成纤维细胞等。可利用活细胞相差显微镜观察并摄影其一般形态结构、超微结构和细胞骨架等。,细胞生长状况,细胞计数，血球计数板和电子细胞计数仪 生长曲线：（潜伏期，对数生长期，水平静止期）由于细胞基数和生长进度不同，生长曲线不一致。 细胞分裂指数，分裂细胞占全部细胞的比例 细胞贴壁率=贴壁存活细胞/接种细胞*100% 细胞周期时间测定：用同位素标记，流式细胞仪测定细胞同期,细胞转化及恶性程度检查,一般利用软琼脂培养法检测,建立细胞株（系）,1）国际和国内被命名的细胞系和细胞株都是一些形态比较均一、生长状态比较稳定和生物性状相对清楚的细胞群。,建立细胞株（系）的要求,1）组织起源和已经传代的代数 2）冻存液 3）细胞活力 4）培养液：培养基、血清和抗生素 5）融解后细胞生长特性 6）接种存活率,7）细胞形态 8）核型 9）无菌检测：细菌、真菌等 10）物种检测：检测同工酶谱 11）反转录酶检测 12）细胞建立者 13）检测者,以美国ATCC细胞库的标准，必须有以下的鉴定数据，才能入库。,3.24培养细胞的污染检测和排除,污染：混入培养环境中对细胞生长有害的成分和造成细胞不纯的异物，包括生物污染和化学物质污染 污染对培养细胞可能有致命的影响,微生物污染途径,a.空气：空气流动性大，如隔离不严，易造成不洁空气的污染。 b.器材：培养器皿、器械，CO2培养箱。 c.操作：无菌观念不强。 d.血清：质量不好、检查不严。 e.组织样本：避免用碘消毒。,污染对细胞的影响,培养细胞一旦发生污染多数将无法挽回 1）轻度时即使去除污染物，可能恢复 2）重度会引起细胞增殖停止，脱壁 3）不同污染物对细胞的影响有差别 支原体、病毒缓慢，长期； 霉菌，细菌短时间内杀灭细胞， 化学物质影响不定,污染的检测,真菌污染：肉眼可见，易发现，有白色或浅黄色污染物 细菌污染：培养物颜色变黄，出现混浊 以上两者都可通过显微镜进一步检测 支原体污染：利用相差油镜，荧光染色法，电镜，DNA分子杂交或支原体培养法以及PCR分子检测,微生物防治,多数污染无法挽救，弃之 细胞培养的关键在于无菌操作 利用抗生素，加温处理，动物体内接种等处理污染。 另外：防止细胞交叉污染,3.3 动物组织培养的技术应用,3.31 细胞培养的药物试验3.32 细胞培养在癌症研究中的应用,3.31 细胞培养的药物试验,优点： 1）可以直接用人细胞作为测试对象 2）细胞的均一性好 3）获得的实验结果比较迅速 4）可结合多种技术方法测知药物效应 5）比动物试验经济,注意事项： 1）体内和体外环境不同，药物试验的结果可能有所偏差。 2）比较适用于单质药物的测试。 3）也可以用来检测“三致”物质，即致突变、畸变和癌变。,细胞选择,实验细胞： 在药物效应不明的情况下，对细胞的选择可以不必十分严格 但对已知药效和想要求得某一类型细胞产生作用时，应采用相应的细胞。,对照细胞： 对照细胞可用同一细胞但不用药物处理或仅用溶媒液处理。 原则上和实验细胞越相似越好。,药物剂量,先测出半效应量IC50，可以按实验者经验确定一组剃度数值进行测试，常用MTT法测定，取50%的效应剂量组作为粗IC50。再进一步获得确切值，取IC50/10做为主要测试剂量。 细胞在受到药物的作用后，其代谢会发生很多影响，形态和生长变化也会发生变化，一般可以大致分为5级。,细胞生长的5个等级,0度：细胞在一定剂量一定时间药物作用下，无任何反应，细胞形态正常，生长能力无改变。 1度：细胞生长速度减慢，细胞分裂指数下降，细胞轮廓增强。 2度：细胞生长缓慢，细胞分裂指数显著下降，或近于消失，细胞轮廓增强，胞质粗糙，内有颗粒堆积。 3度：细胞生长完全停止，分裂相消失，细胞回缩，相互间隙增大，细胞轮廓明显，胞质极度粗糙，内充满多量堆积物。 4度：大部分细胞脱落死亡，残余的细胞亦死亡或崩溃融解。,观测指标,1）化学成份：药物会使细胞内某种成分合成受抑制，可以测量该种成分的含量，分析药理。可以用组织化学方法或电泳的方法检测。 2）形态结构：利用超微结构可以观测细胞各种改变。 3）生长和增殖速率。 4）细胞死亡：在一定的时间范围内来确定细胞死亡的数目。,1）利用人工诱发体外培养细胞的转化来研究癌变的原理。 2）利用培养细胞进行抗癌药物的检测 3）对癌基因的研究,3.32 细胞培养在癌症研究中的应用,细胞转化,定义：细胞发生遗传性改变的一种变化。其性状可以代代相传，能够长期维持和存在。分为一般转化和恶性转化。 细胞自发转化：没有使用任何诱变剂处理下，细胞自发出现的转化现象。 人工诱发细胞恶性转化：利用化学、物理或生物的各种致癌物人为诱发细胞发生恶性转化。 直接致癌物：甲基硝基亚硝基胍（MNNG）等 间接致癌物：需经过酶的活化才会形成终末致癌物，导致致癌作用。,细胞转化的过程,人工诱发转化实验的程序,转化细胞的性状,肿瘤细胞的抗癌药物试验,肿瘤细胞一般取自患者，对于实体瘤患者可以取原发肿瘤组织或转移灶；有肿瘤性胸、腹腔炎的患者可以用离心法取自胸水或腹水，白血病患者可以取自血液或骨髓液进行培养。,肿瘤细胞的培养方法,原代培养： 1）取材来自肿瘤细胞集中、活力较好的部分 2）防止污染 3）及时去除成纤维细胞 4）避免交叉污染,传代培养： 1）等到癌细胞长满培养瓶表面，不要急于传代。 2）在早期传代培养中，应适当提高接种细胞密度 3)消除成纤维细胞,培养肿瘤细胞的生物学测定,1）组织起源 2）形态学观察 3）细胞生长特征 4）软琼脂培养 5）细胞核型分析 6）动物致癌试验 7）组织化学检查 8）凝集试验等,人癌细胞的个别特性 1）一些内分泌腺的肿瘤能产生激素。2）有的非内分泌脏器的肿瘤会产生激素。 3）癌胚性蛋白质,药物疗效的评价,体外抑瘤试验： 多数药物的半数抑制浓度IC50104细胞/ml） 4）经常检测培养条件的质量 5）使用高度纯净的试剂 6）先要配制母液,无血清培养的操作中注意问题,3.4动物组织培养的进展,3.41无血清培养技术 3.42大规模细胞培养技术 3.43特种细胞组织培养 3.44种质资源的长期保存,3.42大规模细胞培养技术,利用大规模培养哺乳类细胞是一项重要的生产生物制品的技术，包括疫苗、干扰素、激素、生长因子和单抗等，具有很高的经济和社会效益，常用的方法有气升式深层培养系统、微载体培养系统、微囊培养系统、大载体培养系统和中空纤维培养系统。,气升式深层培养系统,全自动气升式深层培养系统为全部密闭结构。混合气体自培养器底部管道输入，气体沿着培养器中央的内管上升，一部分气体，从培养器的顶部溢出，另一部分气体被引导沿培养器的内缘下降，直达培养器底部和新吹人的气体混合而再度上升，这样借助气体的上下，不断循环，搅动培养器内的细胞，通过微机程序控制混合气体的组分，维持培养液内一定的溶氧和pH值。,优点,1）没有移动部件； 2）完全密封； 3）便于无菌操作； 4）不易污染； 5）设计简单； 6）便于放大生产； 7)氧的转化率等，满足了该培养系统中细胞在生长时所需的要求。,微载体培养系统,原理：利用固体小颗粒作为载体，细胞附着之，通过连续搅拌悬浮于培养液中。由于扩大了细胞的附着面，提高了细胞的生长效率和产量。微载体是由天然葡萄糖聚合物（葡聚糖）或者各种合成的聚合物组成的。目前商品化的有Cytodex，biocarrier，gelibead，和DEAEcellose等。,微载体及性质,微囊培养系统,微囊法主要适用于生产单克隆抗体，其原理是将细胞悬浮于藻酸钠溶液中，当溶液通过一个可形成小滴的装置，滴入二氯化钙溶液，能形成凝聚小球。小球先后用聚-L-赖氨酸和聚乙烯胺溶液洗时，表面可形成一层半透膜。细胞可在半透膜内生存，代谢过程中的废物可通过半透膜不断排出，而分泌的抗体则积累在半透膜形成的囊内。小球离心破碎后，可得到大量纯度很高的单克隆抗体。,中空纤维培养系统,中空纤维是聚砜或丙烯的聚合物制成，一个培养筒内由数千根中空纤维所组成，然后封存在特制的圆筒中，组成的培养系统。每根纤维管内成为“内室”，可灌流无血清培养液供细胞生长；管与管之间称为“外室”。接种的细胞就贴在管壁上，并吸取“内室”渗透出来的养分，迅速生长繁殖。,3.4动物组织培养的进展,3.41无血清培养技术 3.42大规模细胞培养技术 3.43特种细胞组织培养 3.44种质资源的长期保存,3.43特种细胞组织培养,表皮细胞的培养,肝细胞,初代组织块培养： 取新鲜肝脏，先剥除被膜和血管等纤维成分，用刀把肝切成1mm3左右的小块，采用贴壁法培养。 次日可以出现生长晕。,初代消化法培养： 从门静脉分支中插管，用无钙缓冲液中清洗肝脏15分钟以清除血液和钙离子，然后用胶原酶液灌注15分钟，再进行23次离心分离，就可以获得肝细胞悬液。将其培养在培养皿的胶