替代毒理学细胞试验

替代毒理学-细胞学,s,王秀会 2014-4-4,s,目录,体外细胞模型的特点,体外细胞模型的应用,总结,s,1.原代培养的细胞和细胞系与机体其他部位不存在任何 关联，且相对较为敏感。2.细胞工程为毒理学研究提供了新工具，将永生细胞系 扩大到特殊功能的细胞系，可以更好的研究作用机制。3.通过早期细胞反应研究预测体内毒性反应，如氧化应 激，谷胱甘肽稳态、细胞应激反应、酶活性变化和细 胞因子反应等。,细胞模型的特点,s,局部毒性评价（皮肤体外试验、眼毒性评价）肝脏毒性评价肾脏毒性评价心脏毒性评价神经毒性评价免疫毒性评价内分泌干扰物毒性评价生殖发育毒性评价遗传毒性和致癌性评价,细胞模型的应用,s,皮肤腐蚀性体外模型：人重组皮肤模型EPISKINTM和EpiDermTM -人角质细胞和人表皮角质细胞皮肤刺激性体外模型：人重组皮肤模型EPISKINTM和EpiDermTM -人角质细胞和人表皮角质细胞皮肤光毒性体外模型： 光毒性筛选试验：3T3成纤维细胞、成纤维细胞层、 人角质形成细胞、肝细胞皮肤过敏性体外模型：树突状细胞、角质形成细胞（KC）,皮肤毒性评价,s,眼毒性评价,细胞种类角质形成细胞成纤维细胞角膜上皮细胞,应用通过检测受试物对离体细胞功能的影响及毒性作用预测眼刺激。,s,肝脏毒性评价,细胞种类原代肝细胞肝细胞系亚细胞,应用和优势1.在缺乏肝外因素的情况下评价肝损伤的可能性，排除了吸收、分布、化学物的肝外代谢、体液因素以及其他部位产生的毒性效应的影响。2.利用人肝细胞进行试验，解决了物种差异问题,s,肾脏毒性评价,细胞种类肾细胞培养（原代肾近曲小管细胞、永生化的肾细胞）细胞系培养（OK细胞系、LLC-PK1细胞系、HK-2细胞系、HKC细胞系、其他细胞系）,应用和优势1.实现可控制条件下研究毒物对某一类型细胞的毒性作用。2.原代肾近曲小管细胞：具有丰富的代谢转化和生物转化功能，保持体内前体细胞分化状态，对外源性的损伤特别敏感，也是肾脏损伤的常见部位。3. OK细胞系能表达大量的受体，成为研究肾小管细胞功能的一个模型。4. HK-2细胞系和HKC细胞系：永生化细胞系，也各具特点。,s,心脏毒性评价,细胞种类心肌细胞（成熟心肌细胞和胚胎心肌细胞）,应用1.心肌细胞具有终未分化的特征，增殖分化能力及其有限；2.可以传代并具有心脏的表型但很难构成细胞系；3.保存时间短；4.细胞结构有别于在体内心肌细胞而收到诸多限制。,s,神经毒性评价,应用用来评价靶细胞对神经毒性物质的毒性效应在细胞和分子水平应答的良好模型。表征上表现为细胞形态、能量代谢、受体相互作用以及神经递质代谢等方面产生影响。反映 机体发育的不同阶段模拟和评价与神经发育相关的改变,细胞种类（原代培养）大脑皮质神经元星形胶质细胞少突胶质细胞小胶质细胞中脑细胞,s,神经毒性评价,应用和特点来源：自发性或化学致癌剂诱发的肿瘤细胞，保持集体中的生理特性，可无限传代，并表现出相当稳定的表型。试验成本低、效率高、符合3R原则细胞系特异性强，能排除原代神经细胞中杂细胞的干扰，检测特异性的指标，从而找到受试物的特殊神经毒性作用。,细胞种类（细胞系）成神经瘤细胞系人 : SK-N-SH/SH-SY5Y小鼠:N2a胶质瘤细胞（人脑神经胶质瘤细胞H4大鼠神经胶质瘤细胞C6）嗜铬细胞瘤细胞(PC12),s,特殊神经病的体外细胞模型：1. PD细胞模型 多巴胺能神经元6-OHDA损伤模型 多巴胺能神经元MPTP损伤模型2.AD细胞模型3.OPIDA细胞模型 体外预测有机磷是否引起迟发性神经毒性的有效模型。,神经毒性评价,s,免疫毒性评价,应用NK细胞杀伤活性检测T淋巴细胞增殖试验B淋巴细胞增殖试验巨噬细胞吞噬活性测定,细胞种类效应细胞（NK细胞）、靶细胞（K562或YAC-1细胞）T淋巴细胞B淋巴细胞 巨噬细胞,s,内分泌干扰物毒性评价,应用MCF-7细胞的竞争性雌激素受体结合试验在外源化学物存在情况下，观察雌二醇与MCF-7细胞表达的雌激素受体的总结合能力变化，从而确定外源性化学物是否可以竞争性的与雌激素受体结合猴肾细胞（COS）结合试验：通过转染使COS细胞表达雄激素受体，能够与标记配体结合,细胞种类MCF-7细胞猴肾细胞（COS）睾丸间质细胞（Leydig）卵巢颗粒层细胞（gtanulosa）,s,生殖毒性评价,应用可以针对生殖发育周期中的某个或某几个特定环节进行单独研究。这些试验有很好的应用前景，但尚需要进行广泛的有效性验证。,细胞种类睾丸组织细胞（精原细胞、精母细胞、精子细胞、支持细胞、睾丸间质细胞、原始生殖细胞培养）卵巢体细胞（颗粒细胞、卵泡膜细胞、黄体细胞）,s,发育毒性评价,应用微团培养用于发育毒性评价的有效性已经得到广泛的验证，并收到国际权威组织如OECD、美国EPA的认可。中脑细胞培养的优点：试验周期短、费用低、重现性好，便于不同实验室间比较，实用的短期体外试验系统。,细胞种类胚胎肢芽细胞微团培养神经嵴细胞分离培养中脑细胞培养视网膜细胞培养胚胎心肌细胞培养胚胎干细胞培养,s,优越性：1.与体内实验相比不用考虑对人及动物的副作用，可以区分受试物的效应细胞为生殖细胞还是体细胞；还可以获得源源不断的细胞用于研究。2.ES细胞对受试物敏感性高于成体组织，并且研究受试物胚胎毒性更简单。3.ES细胞具有多能性，可在不同诱导条件下向不同的组织器官细胞分化。4.检测受试物对ES细胞的发育全过程，提高了检测胚胎毒性的准确度。缺点：1.ES细胞在体外培养条件不可能与体内胚胎中多能细胞的生长条件完全一致，从体外结论向体内的推断，降低实验结果的可靠性。2. 诱变剂本身具有毒性，分化细胞特异性与检测结果的准确性的平衡仍需要进一步的研究。3.诱导剂诱导后含有很多其他形式和特性的细胞，因此受试物的作用结果可靠性也受到了质疑。,胚胎干细胞(ES细胞)的应用,s,遗传毒性评价,应用细菌回复突变试验,种类组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门菌色氨酸营养缺陷型大肠埃希菌,s,遗传毒性评价,应用微核试验（细胞胞质阻断法微核试验）,细胞种类中国仓鼠肺细胞株（CHL）卵巢细胞株（CHO）人或其他哺乳动物外周血淋巴细胞,s,遗传毒性评价,应用染色体畸变实验,细胞种类中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中国仓鼠肺（CHL / V79）细胞外周血淋巴细胞,s,遗传毒性评价,应用小鼠淋巴瘤细胞tk基因突变试验（正向突变试验）小鼠淋巴瘤（L5178Y）细胞胸苷激酶位点突变检测。CHO细胞及中国仓鼠肺V79细胞次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖基酶位点突变检测。,细胞种类小鼠淋巴瘤（L5178Y）细胞中国仓鼠肺V79细胞CHO细胞,s,遗传毒性评价,应用程序外DNA合成试验,细胞种类大鼠原代培养肝细胞人成纤维细胞周血淋巴细胞单核细胞Hela细胞羊膜细胞FL,s,致癌性评价,应用哺乳动物细胞体外恶性转化试验,细胞种类原代细胞：叙利亚仓鼠胚胎细胞（SHE细胞）人纤维细胞细胞系：BALB/c-3T3C3H/10T1/2BHK-21,s,1.随着细胞分子生物学理论和方法在毒理学研究中的应用，对外源化学物的毒性评价已经发展到将体内试验与体外细胞分子水平相结合的毒性测试新模型。2.细胞体外试验作为某些体内试验的补充和替代,总结,谢谢敬请各位老师同学的指点