与菌落结果有关的因素

菌落总数就是指在一定条件下 如需氧情况 营养条件 pH 培养温度和时间 等 每克 每毫升 检样所生长出来的细菌菌落总数 按国家标准方法规定 即在 需氧情况下 37 培养 48h 能在普通营养琼脂平板上生长的细菌菌落总数 所 以厌氧或微需氧菌 有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌 由于现有条件不能满 足其生理需求 故难以繁殖生长 因此菌落总数并不表示实际中的所有细菌总数 菌落总数并不能区分其中细菌的种类 所以有时被称为杂菌数 需氧菌数等 细菌菌落总数检测常见误差原因分析细菌菌落总数检测常见误差原因分析 录入时间 2011 9 30 14 18 25 来源 维普资讯 细菌菌落总数是微生态制剂样品检测必做的一项指标 菌落总数检测同其他检验一样 也存 在检测误差 平板计数法是检测饲料中细菌总数 活酵母数 芽孢杆菌数及乳酸菌数的常用方法 之一 因此 该值准确与否直接关系到微生物饲料添加剂类产品的质量好坏 微生物平板计数的 通常方法为每个样品用 3 个稀释度 每个稀释度常做 3 个重复 但如何对平板菌落进行正确计 数 3 个稀释度以哪一个稀释度进行计数及微生物检测允许误差等问题 在饲料标准中并未有所 规定 而这些问题与统计值的准确性密切相关 我们就实际检测芽孢杆菌工作中遇到一些菌落计 数的问题 与大家进行探讨 1 材料与方法 1 1 试验材料 1 1 1 样品 随机抽取微生态饲料添加剂合生素样品 3 份 1 1 2 培养基 营养琼脂 1 1 3 仪器设备 磁力搅拌器 无菌培养皿 培养箱 振荡器 1 2 试验方法 1 2 1 样品的振荡时间对菌数检测的影响 选择 1 个样品 称取 10 g 放入无菌锥形瓶内 加入 90 mL 无离子水 磁力搅拌分别为 l0 20 30 40 和 60 min 用 1 mL 移液枪从中吸取 1 mL 样品悬浊液加入到盛有 9 mL 去离子水的试管中 用振荡器使 样品充分均匀 以此类推 制成 10 1 1O 7不同稀释度的样品溶液 平板涂布法检测菌含量 用移液枪从样品稀释液中各吸取 200uL 每个样品稀释液 3 个重复 将平板倒置于 35 37 培养箱中培养 24 h 1 2 2 检测方法对菌数检测的影响 各个样品称取 l0 g 放入无菌锥形瓶内 加入 90 mL 无离子水 磁力搅拌分别为 40 min 并稀释成 10 1 l0 7 不同稀释度的样品溶液 倾注平板法检测菌含量 用移液枪从各个平行样品相应稀释液中各吸取 1 mL 每个样品稀 释液 3 个重复 待培养基表面干燥后 将平板倒置于 35 37 培养箱中培养 24 h 平板涂布法检测菌含量 用移液枪从各个平行样品相应稀释液中各吸取 200uL 涂布平板 每个样品稀释液 3 个重复 将平板倒置于 35 37 培养箱中培养 24 h 2 结果 2 1 样品的振荡时间对菌数检测结果的影响 采用细菌平板计数的方法 不同振荡时间对合生素中芽孢杆菌检出量的结果见表 1 从表 l 中可见 不同振荡时间获得的细菌菌落数量有较大差别 总体而言 在一定时间内 随着振荡时 间的延长检出有效菌含量增加 说明细菌从载体上解析需要一定的时间 当振荡时间为 40 min 后产品中的菌含量基本稳定 采用适当振荡时间才能更精确的显示产品中有效菌的含量 表 1 震荡时间对有效菌含量结果的影响 亿 CFU g 震荡时间 10min20min30min40min60min 含菌量 2610 51514 2 2 检测方法对菌数检测结果的影响 表 2 检测方法对有效菌含量结果的影响 亿 CFU g 样品平行 检测方法 123 倾注平板法检测 有效菌含量 16 113 015 3 平板涂布法检测 有效菌含量 14 511 214 2 采用不同的检测方法 对合生素中芽孢杆菌检出量的结果见表 2 从表 2 可见 不同方法获 得的细菌菌落数量有差别 倾注平板法相较平板涂布法检测的菌含量多 但基本在 20 误差范 围内 平板计数法操作相对简单 快捷且影响因素较少 倾注法培养基营养分布较均匀 对部分 蔓延菌落能控制 但对操作人员熟练程度要求相对较高 3 分析与讨论 3 1 样品处理对结果的影响 取样时对样品取样口和取样工具要消毒 防止样品交叉污染 3 2 样品的均质处理对结果的影响 固体样品要用均质器或玻璃珠等充分均质 也可在稀释液中添加相应溶解液 如吐温 80 和 液体石蜡等 的稀释液 以保证样品的充分均质 测定芽孢杆菌活菌数时 不同振荡时间获得的细菌菌落数量有较大差别 因为细菌从载体上 解析并均匀分散到溶液中需要一定的时间 待测样品应在振荡器上充分振荡 使得芽孢杆菌可以 充分和均匀地分散到待测溶液中 避免因为菌体未完全释放而引起结果中细菌含量偏低的现象 3 3 试验过程中操作方法的影响 加样 l mL 时 用 1 mL 的吸管并且每做一个稀释度都要换 1 支吸管 否则稀释度间菌落计数 误差会超过 10 说明存在操作误差 用吸管向平皿里加样 平皿开口要小 吸管要直立且加 样结束后 让吸头接触皿底干燥处 保证加样的体积不少 若采取倾注平板法时 平皿加样后要及时倾注琼脂 其间隔一般不超过 20 min 最好在 10 min 内 以琼脂不烫手 约 45 为宜 否则会杀灭细菌 太热也会使冷凝水过多 影响细菌的 生长 加入琼脂要及时摇匀 先向一个方向旋转 然后向另一方向旋转 这样会减少菌落的集聚 和连片现象 另外 用力不要过大 使琼脂不溅到皿壁和皿盖上 保证计数结果的准确 当琼脂 凝固后 要及时移入培养箱倒置培养 若采用涂布平板法进行检测 放置适当时间后 则立即将 平皿翻转后放置培养箱中进行培养 以避免菌落蔓延生长 难以计数 为保证结果准确 除作琼脂的空白对照外 还要对菌落计数的全程做一对照 3 4 菌落计数误差 菌落计数在完成培养后应立即进行 以防菌落继续生长蔓延从而影响测定结果 培养基中加 入 TTC 氯化三苯四氮唑 可使细菌菌落显红色 这样可与同样品颗粒和凝集物 白色 相区分 以提高菌落计数的准确性 有学者认为 100 mL 培养基中加入 2 3 mL 的 TTC 可使菌落着色且 不抑制细菌的生长 菌落计数时要 2 个人分别用菌落计数器计数菌落总数 取 2 个人的平均数报告菌落总数 一般来说 每平板含 20 200 个菌落的稀释度的菌含量与实际结果最接近 超过 200 个 平 皿或小于 2O 个 平皿的计数结果则可能与实际存在较大差别 因此 应尽量选择 20 200 个 平皿的稀释度进行芽孢杆菌的计数 保证菌落计数的有效性 报告结果要遵守国标中菌落计数的 方法进行 4 小结 菌落数检测的误差可能来自于多个方面 试验研究表明 除了