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高分子材料
专业文献
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生物活性蛋白的功能化,高分子材料,专业文献
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生物活性蛋白的功能化 聚乳酸膜 改进的生物相容性 摘要 ：生物相容性是许多成功应用生物材料的一个主要挑战。在这项研究中，为了提高生物相容性，涂层的化学和酶活性的聚（ 变性的人血清白蛋白膜。 3 -（ 3化二亚胺（ 盐酸作为异型双功能交联剂促进了 这导致增加了亲水性（最低的水的接触角为 43 和 35）和最高的抗氧化活性（淬火 79 m 和 115 m 角质酶预处理膜，分别）。 改性聚乳酸膜的 胺键， 现在 36003000厘米和 17001500厘米（图 3）。 骨细胞样、 究证明， 聚乳酸在美国食品、药物管理局（ 欧洲监管部门的食品中得到应用，许多医学领域的应用 1 3已被 证明是可以定制成一个高度灵活的聚合物产品范围的频谱，从包装材料，药物传输系统，植入材料，手术材料，组织工程支架对骨的固定装置（板，销，螺丝等 4。虽然解放军已被批准用于这些应用 4,9，一些研究也显示了一些与人体解放军基础产品与生物相容性的问题，包括诱导结节和异物肉芽肿 10，和相关联的接触植入后炎症 11。 疏水性也影响着细胞附着，生存和增殖 12因此，包括那些使用天然材料，如明胶，胶原蛋白，海藻酸盐或生物素涂覆聚合物的许多策略正在调查，以提高我军基于生物材料16,17的 生物相容性。不同于这些研究的是，本研究探讨通过化学和酶促接枝热变性（展开）人血清白蛋白来提高生物相容性，亲水性和 的抗氧化性能的可能性。人血白蛋白被选为这个应用程序，是因为它不参与止血，是一个已知良好的血液接触材 18,19，并不会触发免疫反应 20。白蛋白 /戊二醛是使用最广泛的一种外科密封剂 21,22和最近的重组人白蛋白称为 23。白蛋白也是一种亲水性生物分子，一个重要的因素生物材料 24正在细胞粘附，存活和增殖的影响。例如，白蛋白涂层已被发现能改善血管内皮细胞的粘 附和生长 25，降低纤维蛋白原的吸附，降低血小板活化 26我们相信这些属性将提高解放军基于生物材料的生物相容性。此外，在血液中，人血清白蛋白是代号，因为它能够代替广泛的活性氧和结合国外的许多分子，金属和有机分子，被一致好评为 海绵或流浪汉流光的流通 。它的抗氧化活性，估计占 70以上的血清中 29。这个属性是用于保持，从而防止氧化应激环境中的氧化还原电位。 料 下列试剂 ;柠檬酸钠，磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，氯化钠，氢氧化钠，乙二胺四乙酸，盐酸，乙醇，甲醇，异丙醇，乙 酸乙酯，德隆 酸钠， N，也纳，奥地利。丁香醛连氮，对硝基苯丁酸酯（ 13 - （ 3 - 二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（ 二氯甲烷（ 良的鹰介质 ;3-4,52胎牛血清，胰蛋白酶，青霉素，链霉素均购自司，奥地利维也纳获得的。考马斯亮蓝 料是从采购也纳，奥地利等其余试剂从 内酰胺，奥地利购买。 司，西班牙巴塞罗那购入。 6小鼠颅盖骨的成骨细胞样细胞系）从本）获得的。来自 由诺维信（请提供外， 丹麦） 。 从栓菌漆酶 制作和先前由努格罗霍 以 摩尔的平均分子量， ， 二氯甲烷（ （体积 /体积）混合物中，从 以达到 10（重量）溶液中的聚合物浓度。 该过程在室温下用磁力搅拌器直至完全溶解。 可生物降解聚（ 电膜是由所描述的罗氏 30和 31 对静电纺丝的制备。获得纤维毡为 700纳米（标准偏差 235 平均直径使用旋转收集器。静电纺丝后得到的聚合物纤维几乎是无定形的 ，如通过 0 至 140 之间的进一步等温退火的温度范围 4 的聚合物控制结晶，而不会干扰纤维形态 32。以这种方式，非导向垫用约制作。 收集在 米直径的鼓。 质酶活力测定 以下通过 5 下用对 基苯丁酸酯 (为底物 33。最终测定的混合物有 200 微升，所用底物浓度的总体积为 50释于 50酸缓冲液 ()。用活性分光光度法通过以下的吸光度增加在 405200读板器（维也纳，奥地利）来确定。 （ E=活性计算的单元，其中 1单位定义为酶的给定反应条件下，以水解为每分钟衬底 1 图 1 考马斯亮蓝 色 图 2 温度对接枝 化 图 3. 牛血清 白蛋白修饰的 图 吸光度 图 吸光度 激活解放军膜之前，他们被削减了 53厘米的片。 为了从膜表面去除污垢可能，他们使用德隆 5 克 /升）， 100其次是使用去离子水，剧烈搅拌两步清洗。每个步骤持续 30分钟，并在 37 下进行两种不同的策略，即，化学（ 的 解）和酶（ 的角质酶水解）被用来激活 00含有 10 U / 在 30 ， 50振荡 2 小时。由布鲁克纳等人的前面的描述进行的 化聚乳酸膜 34。后活化的样品用上述同样的三个步骤再次洗涤。 放军膜与人血清白蛋白的表面改性 为了提 高人血清白蛋白的嫁接，并增加表面覆盖白蛋白中国人民解放军膜，在 37， 70， 80和 90 结合预热（展开）白蛋白的影响的研究。表面活化过程中所产生的 53厘米的块）直接反应，与白蛋白或进一步孵育 10毫克 /毫升的异双功能交联剂 1 - 乙基 （ 3 - 二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（ 0 下加入预热白蛋白（ 4毫克 /毫升的 并在30 培养 24h，然后在磷酸缓冲盐溶液（ 溶解 4h。在这种情况下， 溶性碳化二亚胺，在这种情况下， 溶性碳化二亚胺，反应以生成 团和自由 团上的白蛋白以形成酰胺键 14。然后将膜取出，从该溶液中，充分洗涤（ 5*蒸馏水） ,两次在甲醇中，然后用双蒸水漂洗，以除去任何未接枝的白蛋白或杂质。 性的 改性的 53厘米件）的亲水性是通过使用一个商业 国）测量接触角在室温影响。后给解放军膜加以干燥洗涤过的未结合白蛋白，水的固着接触角根 据使用 5测角仪和 件的杨 - 拉普拉斯法测定滴沉积后五秒钟。滴体积是 每个 点，结果取平均值。根据所使用的 人 35的方法的程序的嫁接的人血清白蛋白，进一步定性地观察到。简单地说，解放军修饰的膜浸泡在考马斯亮的解决方案蓝 色，孵育 30 分钟，脱色用含 5甲醇， 酸，双蒸水（体积 /体积 /体积），并进一步漂洗用双蒸水中的溶液。 性的 得到在 仪 2000 术。充分洗涤并干燥聚乳酸膜（ 53厘米的片）用 光谱记录在 4000厘米有 16 次扫描 1 厘米的分辨率，以 用总抗氧化能力测定四甲 四甲 生产如先前由努格罗霍 简言之，丁香醛连氮（ 育与漆酶 5020 升）来自 T。 蝇 漆酶 生产和先前由努格 罗霍 36。在 50 0 分钟 30 丁香醛连氮的漆酶氧化反应进行下在 10用 04游离 后加入 500 毫升液体乙酸乙酯萃取并回收在真空下固体形式。未改性的和改性的 53厘米的块）中孵育 分别与 200V/双蒸 30 ，而以 140 小时。30，监测波长的减小的吸光度与对 照相比。 对于细胞活力研究，从不同的处理，如上所述圆形 细胞接种之前被切成 1 厘米直径大小和膜 3 小时灭菌紫外线。 胞和成骨细胞（ 2104养于 含有 1克 /升葡萄糖中，补充了 10胎牛血清（ 费希尔）和青霉素 /链霉素 1，在37 下在含 5 95的加湿空气。为了评价细胞生存力和在不同的 胞被接种到覆盖有涂层的聚乳酸膜，并温育 5 天 24 孔 中。对细胞活力的定量，将细胞转移到新的板和（ 3 - （ 4,5 - 二甲基吡啶 基） - 二苯基溴化）加入 37。培养基中和过量的（ 3 - （ 4,5 - 二甲基吡啶 基） - 二苯基溴化四）保温 1 小时后除去，并用 异丙醇中以溶解已转换的染料代替。溶解的转换的染料（ 150每孔中转移到另一 96孔板中，并测量了转换后的染料的吸光度值在 540国。四个读数为各样品的平均值作为最终结果。细胞存活率表示为用于组织培养聚苯乙烯（ 同一培养基的吸光值的比例。 3结果与讨论 使用不同的策略包括测量增加亲水性聚乳酸膜的表面功能监测，傅里叶变换红外光谱（ 抗氧化能力和细胞活力。在初步筛选阶段，以展开蛋白质，增加中国人民解放军膜的结合表面面积在 37， 70， 80和 90 进行了调查预热人血清白蛋白的影响。如图 1 所示，角质酶水解 化的修饰人血清白蛋白预热至 80 显示如由蓝染色（图 1）的最高白蛋白结合容量和增加的抗氧化活性（图 2）。这些结果进一步证实在抗氧化活性所观察到的增加。 与人 血清白蛋白预热至 80 对待处理的膜 4C 显示抗氧化活性，然后用氢氧化钠（图 2）激活各自 这可能表明，在 80 中的白蛋白被充分伸展（展开）允许多个结合位点上的 表面，也暴露了一些氨基酸，具有抗氧化性质。加热的人血清白蛋白在 80 ，因此有可能暴露已知形成二硫键的三级结构 38藏的 35个半胱氨酸残基。半胱氨酸是一种知名的抗氧化剂。出人意料的是， 然人血清白蛋白预热至 70 的例子表明在抗氧化活性略有增加。 角质酶的抗氧化活性和 化的样品，因此可 能归因于活化解放军膜的程度之间的差异由不同的系统造成。 因此，进一步进行了研究，与人血清白蛋白预热至 80 。从 10毫克 /毫升增加 浓度为 20 毫克 /毫升和白蛋白预热至 80 共 4 毫克 /毫升至 12 毫克 /毫升反应混合物中 C 的浓度导致增加的亲水性（测量接触角）和总的抗氧化活性 角质酶和与 作交联剂（表 1）相比，筛选在图 2 期间获得的结果活化的膜。所有改性的 具有水接触角比未处理的样品（见表 1）下，虽然不同的治疗导致了不同的亲水性。水解角质酶处理过的 修饰的白蛋白和 理过的与 解 1）与接触角低至 43 和 35 。这再次表明并确认治疗 角质酶是能够水解酯键的聚乳酸，从而生成 团的反应，然后用 而解放军再加 供免费 这项研究中的重要性不能被过分强调就证明了这两种降低接触角和相应的解放军膜（表 1）的总抗氧化活性。 联的蛋白质的核酸，以及制备免疫偶联物 42在总的抗氧化活性 的增加（量猝灭 ）进一步证实确实白蛋白被成功接枝到聚乳酸膜和加热白蛋白有助于暴露的氨基酸基团与掩埋的 3构内的抗氧化性能。增加亲水性基团，如 少水的接触角）的 些亲水基团是重要的，因为它们既在培养基中的蛋白质，糖蛋白和蛋白聚糖和细胞膜，从而加速细胞的粘附，改善生物相容性交互。 红外光谱测量对 之前和之后进行的修改也证实，的确是人血白蛋白被成功嫁接到解放军膜与 角质酶激活两个解放军膜，用 一步修改与人血清白蛋白预热在 80 （图处理 图 3a和 b）所示。未改性的 3000到 2944= 751 3a和 b）。 成功的人血清白蛋白的耦合证明新兴 ，酰胺键和侧链伸展 3700和 3000 700 看似 1500 3b。这些峰被分配到的 胺（主要是 酰胺 （主要是 C=O 伸缩振动）和酰胺 （ 曲振动与伸缩 振动的耦合），分别为 45。在 3200域代表部分用不同的产地，即酰胺 I， 6。 成骨细胞样和 胞的活力和增殖的改性聚乳酸膜，进一步研究了在一段 5天（图 4b）。虽然细胞生存力和非改性的 继续增加，它极大地提高了所有改性的 4b）。些研究是与以前的研究显示出，细胞相容性是由娇等人 47谁也指出，加入牛血清白蛋白显著提升对 17的研究一致。同样， 角质酶水解的聚 乳酸膜与假想增加 团表现出较少的细胞活力相比类似 4b）。 解放军启动进一步修改与作为水解角质酶与经发会处理两个解放军膜可见一斑增强细胞活力和修饰白蛋白以及水解用 疗解放军膜和修饰白蛋白（图 4a 和 4b 白蛋白改善细胞相容性表面）。将细胞分散得很好，并强烈与表面相互作用并在整个表面上覆盖由形成均匀和连续的单层细胞。这些结果表明，聚乳酸膜与人血清白蛋白预热至 80 的变形能提高细胞的附着，铺展，形态学，增殖和活力。此外，尽管传统 的湿法化学方法或等离子体方法已被普遍用于官能本研究中的角质酶的聚酯 48的表面也被证明是能够水解聚乳酸膜的酯键，使之成为一种有吸引力的替代工具解放军功能化。事实上，许多酶如酯酶49，脂肪酶 50和角质酶 51已经成功地用于水解的聚酯主链使后续官能化步骤。酶通常被视为环境友好和高选择性催化剂。 这项研究表明， 可化学和酶促导致形成 能团，它们可以用一个异双功能交联剂 (导致与人血清白蛋白的成功移植预热至 80 下进一步反应活性。 析，的确证实了白蛋白被成功嫁 接到解放军膜。这些表面修饰策略增加了亲水性，聚乳酸膜清除自由基的能力，因此细胞活力以及成骨细胞和 这表明，该接枝的人血清白蛋白的亲水性基团是重要的为聚乳酸膜，并导致改进的细胞之间的相互作用促进细胞相容性。 致谢 这项工作已经得到了联邦经济，家庭与青年 (联邦交通，创新和技术 (施蒂利亚州商业，通过奥地利研究促进署护卫舰和 罗尔和 技术。 参考文献： 1 G. T. T. 2 (2002) 67. 2 L. S. C. T. 32 (2007) 762. 3 J. S. A. G. 1 (2000) 431. 4 B. N. J. 34 (2007) 455. 5 K. J. R. M. T. R. M. J. 103 (2009) 1214. 6 M. S. R. G. M. N. N. J. 18 (1995) 772. 7 P. P. R. J. 13 (2002) 469. 8 Y. S. P. R. (2009) 259. 9 B. S. H. 4 (2004) 835. 10 M. S. J. 6 (2007) 95. 11 G. 8(2007) 5137. 12 D. S. C. J. 20 (2010) 189. 13 Y. D. J. 87B (2008) 59. 14 Y. C. Y. J. J. 69A (2004) 436. 15 Y. L. P. X. (2006) 155. 16 T. O(2004) 463. 17 Z. C. Y. J. J. J. 63 (2002) 838. 18 E. L. , 1987, p. 25. 19 Y. N. R. R. M. Y. 17 (1996) 3. 20 C. C. J. 17 (2007) 33763384. 21 J. H. S. O74 (2002) 432437. 22 J. 72 (2012) 796798. 23 24 103 (2003) 384. 25 M. L. R. F. A. J. 5 (1994) 808. 26 V. 2 (2001) 1. 27 H. 21 (2010) 647. 28 M. E. A. A. P. M. J. 86A (2008) 769. 29 E. T. W. M. W. 49 (2010) 12051211. 30 M. P. E. E. 582 (2008) 1783. 31 C. V. S. 12 (2011) 015001,32 C. V. C. S. J. 12 (2012) 19,33 D. E. K. A. S. R. G. K. H. G. (2012) 617. 34 T. A. S. M. J. A 46 (2008) 6435. 35 S. 4 (2006)359370. 36 E. T. W. M. 118 (2010) 437. 37 M. H. 3 (2002) 3927. 38 B. 582 (2008) 17831787. 39 69 (1986) 119127. 40 G. A. V. M. M. P. 33 (2012) 209290. 41 E. N. L. D. 39 (2005) 1520. 42 6 (2006) 306311. 43 G. P. 30 (2006) 345348. 44 M. 36 (1995)83458346. 45 W. Y. J. 26 (2008) 425. 46 J. 1 (2002) 23. 47 Y. Z. X. C. J. 125 (2012) 48 L. S. , 5, 2010, p. 150. 49 A. S. R. F. S. A. J. 135 (2008) 45. 50 E. D. G. K. K. I. E. R. W. M. A. G. H. 41 (2011) 4632. 51 D. S. E. E. K. R. R. S. P. 27 (2011)951. 4, 4710v. 47, 08028 to 48)LA 4,9, of of LA is 6,17LA by it in is a 18,19 20. as a 21,22 23. is a an on 2/1, 3 (2013) 13991404 13 be a be a of LA LA of - 211 2013 (359 lM 15 lM of LA to 6003000 500 3). .4 as to LA of LA 013 by S as as 10 11. to 1215. or e 01347150, 3430 is a of In to (to or as a NH of in . 2/1, . , e, e,f, b,d,e, e,00 235 a as SC at in 0 40 32. In in a 0.3 cm 5 as on 24. to 25, 2628. We LA in is or of of up a of is to 0% of 29. is of N, 1 s 3-4,52,5 of g an as as et 29. LA an g a 3/7 (v/v) ,to 0 in at a by as et 30 et 31. et et 33 a 00 0 mM 0 mM at . by 05 nm a 200 (e = in as of of LA of LA cm In to 5 g/l),100 mM by 7 LA LA to LA mM 0 U/ml 0 h 0 LA et 34. LA to of by on LA of 7, 70, 800 5cm
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