裂殖酵母的比较功能基因组学

1 6 裂殖酵母的比较功能基因组学 裂殖酵母菌属包括粟酒裂殖酵母 S pombe 八胞裂殖酵母 S octosporus 嗜冷裂殖酵母 S cryophilus 和刺参裂殖酵母 S japonicus 它们占了子囊菌纲的基本分支并且是真核细胞生 物学的一个重要模型 比较这些基因组的注释 我们发现了濒临灭绝的转座子并展开了自 由转座子着丝粒方面的创新 表达分析确定了减数分裂基因在营养生长期服从反义转录 这表明了它们严格的调控机制 此外 反式作用调节因子可控制扩展功能模块范围内的减 数分裂和应激反应的新基因 基因的内容和调控的差异可以解释为什么不同于酵母菌亚门 的芽殖酵母 裂殖酵母不能使用乙醇作为主要的碳源 这些分析阐明了裂殖酵母的基因组 结构和基因调控并为整个裂殖酵母菌属的研究提供了工具 裂殖酵母菌种裂殖酵母在具有与众不同的生活史的子囊菌 图 1A 里形成了一个广泛而古 老的群体 1 裂殖酵母作为单倍体优先生长 以二分裂而不是不对称出芽的方式增殖 并 且已形成了一种独立于芽殖酵母 酵母菌亚门 的单细胞生物生活方式 裂殖酵母与后生 动物拥有许多相同的重要生物过程 包括染色体的结构和代谢 染色体相对较大 多重 复性的着丝粒 低复杂度的复制起点 异染色质组蛋白甲基化修饰 染色质异染色质蛋白 小分子干扰 RNA siRNA 调控的异染色质 和 TRF 家族端粒结合蛋白 G2 M 细胞周期 调控 细胞分裂 线粒体的翻译密码子 RNA 干扰 RNAi 途径 信号传导体途径以及剪接 体的组成 这些特点在芽殖酵母中缺失或高度分化 一般情况下 比起其它的子囊菌纲 裂殖酵母的核心同源基因更接近于后生动物 2 裂殖酵母也在碳源代谢进化上产生创新 包括葡萄糖有氧发酵成乙醇 3 这种趋同进化的芽殖酵母酿酒酵母为复杂表型的进化提供 了深入了解 粟酒裂殖酵母被广泛使用作为研究细胞中基本生物过程和与人类疾病相关基因的模型 为 了更好地了解它的进化和自然历史 我们比较了所有已知的裂殖酵母 粟酒裂殖酵母 八胞裂殖酵母 嗜冷裂殖酵母和刺参裂殖酵母 的基因组和转录 基因组序列和系统发育 基因组序列和系统发育 通过使用 clone based 和 clone free 全基因组鸟枪法 WGS 表 S1 我们测序和组装了八胞裂殖酵母 嗜冷裂殖酵母和刺参裂殖酵母的基因组 每个基因组约 11 5 Mb 大小 八胞裂殖酵母和嗜冷裂殖酵母是 38 GC 刺参裂殖酵母是 44 通过比较 粟酒裂殖酵母的基因组是 12 5 Mb 的大小和 36 GC 我们组装八胞裂殖酵母和刺参裂殖 酵母支架成三个全长的染色体 其质量类似于已形成的粟酒裂殖酵母的基因组 图 1B 和 图 S1 S2 以及表 S2 和 S3 并使用 WGS 数据鉴定了端粒序列 4 在刺参裂殖酵母 GTCTTA 八胞裂殖酵母 GGGTTACTT 和嗜冷裂殖酵母 GGGTTACTT 中假定的端粒 酶 RNA 位点 端粒重复符合一个半的重复单元的序列 类似于粟酒裂殖酵母 GGTTAC 中 的结构 5 通过使用这些基序 我们扩展刺参裂殖酵母和八胞裂殖酵母染色体到亚端粒和 端粒序列 4 从 440 个单拷贝核心同源基因中 我们构建了子囊菌门裂殖酵母纲的系统发育 图 1A 和 图 S3 将单系类群的裂殖酵母物种作为一个基础的姐妹群分化支 其中包括丝状真菌 盘菌亚门 和芽殖酵母 酵母菌亚门 当我们比较粟酒裂殖酵母和刺参裂殖酵母时 发 现了在所有的 1 1 同源基因间 氨基酸序列同源性平均为 55 类似于人与头索动物文昌 鱼 表 S4 对于最密切相关的物种 嗜冷裂殖酵母和八胞裂殖酵母 1 1 的同源基因拥有 85 的同源性 类似于人类和狗 粟酒裂殖酵母的遗传多样性低 通过全基因组鸟枪法分 2 6 析 将粟酒裂殖酵母 972 菌株与两个表型不同的菌株粟酒裂殖酵母 NCYC132 菌株和粟酒 裂殖酵母变种 kambucha 菌株比较 结果显示 3 株之间不到 1 的核苷酸差异 图 S4 和表 S5 转座子的根除和着丝粒结构的重组 转座子的根除和着丝粒结构的重组 对于通过异染色质维持着丝粒的功能 转座子和其它 重复序列被认为是至关重要的 6 这些序列发展非常迅速 但目前还不清楚着丝粒 转座 子和异染色质之间的进化关系 部分是因为真菌的着丝粒一般不包括在基因组聚合物中 刺参裂殖酵母基因组有 10 个 gypsy 类的反转录转座子家族 4 图 S5 和表 S6 它们的反 转录酶序列分歧表明 这些转座子家族的形成早于子囊菌纲最后的共同祖先 然而 转座 子的一个巨大缺失出现在刺参裂殖酵母的分歧之后 粟酒裂殖酵母含有两个相关的反转录 转座子 Tf1 和 Tf2 嗜冷裂殖酵母有一个单个相关的反转录转座子 Tcry1 八胞裂殖酵母无 转座子 但含有可能代表了灭绝的转座子的逆转录酶和整合酶的相关序列 S5 和表 S6 转座子在裂殖酵母物种进化出现刺参裂殖酵母之后的消失 与 cbp1 基因家族的出现相关 这表明着丝粒功能的控制下的过渡 在粟酒裂殖酵母中 Cbp1 蛋白结合着丝粒重复序列并 且是转座子沉默和维持基因组稳定性所需 7 8 虽然被称为一种人类着丝粒结合蛋白 CENP B 的同源基因 但在裂殖酵母系谱中 Cbp1 蛋白明显从被驯化的 Pogo like DNA 转 座子独立进化 9 cbp1 基因家族的出现也关系到从刺参裂殖酵母 见下面 中 RNAi 介 导的转座子沉默到粟酒裂殖酵母中 Cbp1 based 机制的切换 这表明 Cbp1 based 转座子控 制的转移可能通过促进长链末端重复序列间的遗传重组基因缺失 LTRs 使大多数来自裂 殖酵母基因组的转座子消除 8 此外 cbp1 家庭发展迅速 图 S6 这表明 Cbp1 based 转 座子沉默是在刺参裂殖酵母分歧出现后的裂殖酵母特有创新 转座子的损失是伴随着由庞大的染色体架构重组省去着丝粒的功能 这表明新颖的着丝粒 结构的进化弥补了转座子的损失 在刺参裂殖酵母中 转座子聚集在端粒和着丝粒附近 如同在后生动物中一样 图 1 B 和 C 在其它的裂殖酵母纲中 亚端粒和近着丝粒也是 重复的 但缺乏转座子 图 1C 然而 像刺参裂殖酵母 着丝粒和亚端粒重复序列被限 制在近着丝粒和亚端粒区域 个别地 有一个例外 着丝粒重复序列在粟酒裂殖酵母交 配型位点处参与转录沉默 10 我们证实了着丝粒是由组蛋白 H3 赖氨酸 9 H3K9 甲基 化定位的异染色质 图 S7 并通过减数分裂定位展示了刺参裂殖酵母着丝粒的功能 表 S2 虽然着丝粒重复序列迅速发展 但即使相关的菌株之间不同 11 个别重复序列往往在菌 株内类似 图 1C 粟酒裂殖酵母 八胞裂殖酵母和嗜冷裂殖酵母的着丝粒重复序列之间 没有任何相似性 然而 粟酒裂殖酵母和八胞裂殖酵母着丝粒都含有重复的组成 染色体 间的高度相似 被排列在有一个独特的核心序列的更大的倒置重复的结构中 图 1C 这 表明它们不可逆重组的均化 和刺参裂殖酵母对称性的缺失对比 可看出换位比起通过重 组的同质化更迅速地发生 因此 抑制换位可能同时导致转座子序列的变性和对称的着丝 粒重复序列的进化 尽管着丝粒序列和排列在染色体臂上基因的分歧 在粟酒裂殖酵母和八胞裂殖酵母间 核 型和近着丝粒的基因排列顺序仍是保守的 图 S8 因此 虽然基因转换在不同的着丝粒 间保持着丝粒重复序列之间的相似性 但是着丝粒间的交叉重组却被抑制 在这些谱系中 我们观察到既无着丝粒的易位也无新着丝粒的活动 即使着丝粒可能会出现在操纵的粟酒 3 6 裂殖酵母菌株的新位置处 12 粟酒裂殖酵母 八胞裂殖酵母和嗜冷裂殖酵母的着丝粒中 重复组成的保留 暗示着即使它们已经失去了它们的转座子 然而着丝粒重复序列仍起重 要的作用 由于 siRNA 涉及到转座子沉默和着丝粒的功能 13 我们研究了在裂殖酵母系谱中它所 起的作用 在粟酒裂殖酵母中 着丝粒重复序列通过 Argonaute 依赖性异染色质形成产生 Dicer 依赖性 siRNA 用于维持着丝粒的结构 功能和转录后沉默 14 不过 粟酒裂殖 酵母中转座子的沉默通过 RNAi 独立机制 不产生大量 siRNA 图 1 和图 S9 7 为 了研究着丝点指导 siRNA 产生的是否是保守的 在刺参裂殖酵母转座子丰富的着丝粒中 我们对刺参裂殖酵母培养皿对数期的小分子 RNA 测序 其中有一个 23 个核苷酸的标准模 板 4 发现 94 定位到转座子 端粒和着丝粒上都有 图 1B 和图 S9 中 在刺参 裂殖酵母而不是粟酒裂殖酵母中 siRNA 定位到转座子的事实表明 无论是裂殖酵母中的 RNAi 途径以重复序列而不是可动组成本身为目标 还是途径演变远离祖先都在转座子控 制中在异染色质功能表达中起到专有作用 交配型位点的演变 交配型位点的演变 在所有 4 种菌种中 交配型位点和用于调节交配型切换的顺式作用组 成的结构是高度保守的 图 S10 表达垫 1 的轨迹可以有正的 P 或负的 M 等位基 因 并在两者之间通过来自两个异染色体联盟沉默供体匣 mat2 P 和 mat3 M 表观遗传编程 的基因转换来切换 15 17 图 S10 及 S11 被用于表观基因印记和重组切换 18 20 的顺式作用调节序列是保守的所需的 4 图 S11 因为是关于垫 1 的表观遗传编程的 基因组标记 15 相反 粟酒裂殖酵母中是没有其他物种可识别的顺式作用序列参与转录抑制沉默匣 即使 供体盒中有富集的 H3K9me 异染色质 图 S7 在刺参裂殖酵母中 沉默垫位点被发现直 接关系 3 号染色体的着丝粒 这表明它们可能由于位置的影响来沉默 在八胞裂殖酵母和 嗜冷裂殖酵母 垫位点远离着丝粒 但每个含有一个转座子的残体的保守区 这可能是沉 默触发器 它们还含有反向重复序列 尽管比起粟酒裂殖酵母中两侧有垫 2 3 轨迹的反向 重复序列更短 更相互类似 21 因此 它们的的沉默策略可以能共享来自于粟酒裂殖 酵母和刺参裂殖酵母的组成 这些结果表明 印迹和切换的机制已被保存 但建立异染色 质的策略是可塑的 比较转录组的注释 比较转录组的注释 我们注明了三个基因组中使用的标准方法并和粟酒裂殖酵母相比较 4 然后 我们深度测序了多聚 A 富集 链特异性的 cDNA 22 24 RNA Seq 并为了对数期 葡萄糖消耗 早期固定相 热休克来自粟酒裂殖酵母 八胞裂殖酵母和刺 参裂殖酵母以及对数期 葡萄糖消耗和热休克来自嗜冷裂殖酵母建造从头转录模型 图 S12 在粟酒裂殖酵母中 我们重建了 5064 个以前注释基因中的 4277 个 剩余的 788 个基因中 有 60 的被覆盖的长度至少有 90 400 个我们转录的模型改变了编码基因的外显子结构 其中 95 保持或改善保守的编码能力 表 S7 和 S8 及图 S12 25 此外 我们确定了 253 个非翻译区 UTR 内含子 最后 我们发现了 89 个新的粟酒裂殖酵母的蛋白质编码 基因 其中 53 个是保守的 表 S7 和图 S13 我们没有发现任何证据说明内含子丰富的 裂殖酵母基因如后生动物般进行选择性剪接 26 在粟酒裂殖酵母我们发现 433 个选择 性剪接活动以内含子保留的形式进行并有选择性的剪接供体或拼接受体的使用 但没有证 4 6 据表明外显子跳跃或外显子可替代 我们还发现与其他物种相似水平的剪接变体 表 S9 然而 由于这些变种破坏编码的能力 图 S14 和 S15 只有一小部分内含子保留物 146 393 被保存在两个或两个以上的物种间 我们认为 在裂殖酵母中的选择性剪接代 表非生产性剪接变异体 有趣的是 在某些情况下 非剪接变种可能是编码蛋白的同种型 图 S14 中 C 和 D 及 S15 和表 S10 转录主要是指蛋白质编码基因的转录 转录主要是指蛋白质编码基因的转录 稳定的裂殖酵母转录的大部分来自于注释的蛋白质 编码基因 大部分的粟酒裂殖酵母的基因组用 91 被至少一个 RNA Seq 读取所涵盖的核 苷酸来转录 22 然而 大多数用稳态聚 A 丰富的 RNA 水平来测算的转录 是与定 义良好的转录本相关 其中大部分是蛋白质编码 具体而言 37 的间隔核苷酸 注释的 蛋白质编码转录的 UTRs 间 不被检测的表示 90 的转录间隔核苷酸只占 0 16 的多聚 A 富集转录信号 此外 外显子序列的中位表达水平 99 1 的被检测表达 是 305 次 的间隔序列 图 2 和表 S11 有在 DNA 复制起源里间隔转录富集 图 S16 基因 自由位点有核小体 自由区域 27 29 可提供异位转录起始的可结合位点 30 编码基因的转录偏重于有义链 编码基因中 73 有 5 的基因反义读取丰富的间隔距离 200 个基点 P 200 基点 P 0 1 这表明多的反义转录是由于通读 3 终止 位点 31 图 S17 因此 在裂殖酵母的基因组中稳定转录主要是与已知的转录单位 相关 我们下面讨论显著的特例 基因内容和结构的保守性 基因内容和结构的保守性 尽管裂殖酵母菌属进化广泛 用氨基酸分歧来测算 它们的基 因内容和结构是显著保守的 在裂殖酵母物种约 5000 个编码基因中 全部菌种中有 4218 个是 1 1 1 1 直系同源物 而自从它们的最后的共同祖先起 其余部分的直系同源中含有的 基因已被复制或删除 表 1 和图 S12 蛋白激酶在基因内容中甚至更保守 93 102 110 的粟酒裂殖酵母蛋白激酶是 1 1 1 1 直系同源物 4 此外 3601 个粟酒 裂殖酵母内含子在 2616 个拼接的 1 1 1 1 直系同源物中 2901 81 个在所有 4 种菌种 中是相同的 表 S13 总体而言 基因内容 基因顺序和基因结构的保守性在裂殖酵母 中高于预期假定的氨基酸分歧水平 从氨基酸的分歧 我们估计 约 220 万年前裂殖酵母 菌属出现 图 S3 然而 基因内容的保守性显着高于酿酒酵母和克鲁维酵母 它们两者 都具有低得多的氨基酸分歧 表 S15 这表明 裂殖酵母氨基酸序列发展异常迅速或基 因组结构异常稳定 大多数基因变化是由于物种和菌属特定基因的获得 表 S12 和 S14 4 我们通过在物 种特异性基因寻找共线性来测定基因是否是由于获得同源基因而快速分歧 我们研究了这 些区域序列相似性的迹象 然后发现了一个 94 317 的粟酒裂殖酵母的特定基因 它在相对 于相邻的基因而言相同的位置正如基因对不同物种的特定性 表 S16 其中 9 个显示对 在另一物种中的同源基因 15 的同一性 这表明它们正在迅速分化成直系同源物 4 我们还发现 34 个来自细菌中粟酒裂殖酵母准备水平层面的基因转移 包括两个已公布的例 子 4 32 33 S17 和其他物种中的相近的数目 其中 16 个似乎在菌属分散前已出 现 9 个似乎对粟酒裂殖酵母是特定的 基因间和反义非编码转录的证据 基因间和反义非编码转录的证据 在粟酒裂殖酵母中由链特异性 RNA Seq 数据支持 我们 5 6 确定了 1097 个公认的转录模型 但它们没有明显的编码能力 并且没有相对应的明确定义 的非编码 RNA ncRNAs 22 24 34 图 S18 和表 S18 S19 在这些潜在的 ncRNAs 中 449 个是间隔的 648 个是反义的 至少 30 在另一条链上重叠一个编码基因 在 ncRNAs 中 213 个在同一条链上重叠注一个注释的 UTR 这表明它们可能是另一种 UTRs 然而 数据表明 338 个间隔的和 546 个反义的 ncRNAs 是作为不同的转录本 4 粟酒裂殖酵母的 338 个不同的间隔的 ncRNAs 138 个是在至少一个其他物种中位置保守 表 S41 此外 26 个间隔 ncRNAs 是序列保守 并且在这些中 9 个是位置和序列都 保守 这表明它们代表潜在的生物学上重要的非编码 RNA 转录本是位置而不是序列保守 可能代表功能的转录在识别上已不同 在反义转录中 328 51 个在两个或多个基因组 中是保守的 表 S20 这表明它们在生物学上的重要性 35 减数分裂转录的反义调控 减数分裂转录的反义调控 在裂殖酵母中 约 250 个基因有更多的反义转录比起对减数分 裂基因是显著富集的有义转录 表 S21 超几何测定 粟酒裂殖酵母中 P 10 10 图 3 图 S19 以及表 S22 和 S23 与在粟酒裂殖酵母和酿酒酵母中观测结果相一致 24 35 已经提出了几种反义转录基因通过内含子保留来进行调节 36 37 然而 这些研究并没有使用链特定的途径 这使得它无法从反义转录中分辨出非拼接的有义转录 我们没有发现任何这些基因的选择性剪接的证据 在减数分裂过程中当同源有义转录增加时 减数分裂基因的反义转录并不是均匀下降 图 S20 这一观察表明 反义转录不抑制有义转录 与在酿酒酵母中观察到的相反 30 35 此外 减数分裂基因在有 5 100 反义转录的基因间是不富集的 超几何 测定 P 0 47 与反义转录本直接结合并抑制稳定性或有义转录的翻译中调控的计量机 制一致 在裂殖酵母里表达程序的全局保守性 在裂殖酵母里表达程序的全局保守性 为了识别共表达基因的保守模型 我们测定了所有 在四种条件和系统进化聚类的 4 种裂殖酵母间的表达模式 图 4 我们发现 在类似条 件下生长的物种之间的基因表达模式一般是保守的 具有与占主导地位的模式相关的生长 对数期和热休克 和压力 葡萄糖消耗和早期固定相 此外 类似的表达集群在不同 物种间富集相似的基因注释 裂殖酵母上行调节的基因关系到有丝分裂 包括那些涉及到 Kineto 核心 纺锤体极体和有 丝分裂后期促进复合物 作为葡萄糖损耗的响应 表 S24 相反 几种参与生长的基因 是下行调节的 4 这些基因中没有在酿酒酵母里葡萄糖耗损中广泛调节的 38 顺式调控机制与新型扩展功能相关 顺式调控机制与新型扩展功能相关 整个子囊菌门中保守的调控功能启动子元件展示了裂 殖酵母间的新功能 例如 在酿酒酵母中 被 Rtg3 界定的元件与整个动物门中氨基酸代谢 基因相关 然而 在裂殖酵母中 它也富集在积极响应于各种应激反应的基因中 图 5A 在粟酒裂殖酵母中有 Rtg3 元件的应激基因 36 被发现只存在于裂殖酵母菌属中 也有 一些关于与 Atf1 元件 一个应激反应的保守调节因子 图 5B 在裂殖酵母菌属中 Rtg3 并没有可检测的直系同源物 39 但在酿酒酵母中由 Rtg3 识别的元件是在裂殖酵母中清 楚可鉴的 这表明这些调控元件是比它们的结合蛋白更保守的 通过在粟酒裂殖酵母中调 节减数分裂转录的 FKH 和 MBF 相关元件 我们也发现了类似的裂殖酵母特定基因的收获 6 6 4 40 41 特别是 这两个元件是富集在反义转录本的基因上 图 5C 大多数有 反义转录本的靶基因 80 47 个基因 的 FKH 一个在粟酒裂殖酵母中被 Mei4 界定的 元件 是减数分裂基因 其中大部分对裂殖酵母菌属是特定的 图 5C 基因内容反映了葡萄糖依赖性生活方式 基因内容反映了葡萄糖依赖性生活方式 酵母属的裂殖酵母和芽殖酵母独立发展能力来通 过好氧发酵生产乙醇 3 42 与乙醇生产的趋同进化相反 乙醇的利用没有相同 虽然 芽殖酵母可以有效地分解代谢乙醇 但是裂殖酵母不能使用乙醇作为主要碳源 在芽殖酵 母中好氧发酵的进化涉及到基因内容