微生物限度检查法.doc

微生物限度检查法微生物限度检查在环境的洁净度10000级和局部100级的单向流空气区域内进行，其全过程应严格遵守无菌操作，以防再污染。单向流空气区域、工作台面及环境必须定期按国家医药工业洁净室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌测试方法现行标准进行洁净度验证。隔离系统按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。灭菌和培养温度 ：细菌培养温度为3035；霉菌、酵母菌培养温度为2328；控制菌培养温度为3537检验量：检验量 指供试品一次检验的用量。一般为10g或10ml；化学药膜剂为100cm2；贵重或微量包装的药品可酌减（不得少于3g）。检查沙门菌的供试品其检验量增加10g或10ml。一般随机抽样不少于检验用量（2个以上最小包装）的3倍量。供试液的制备 ：用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制备供试液或选用适宜的乳化剂、分散剂、中和剂制备供试液；其用量应验证，在该检验条件无抗菌作用。供试液制备妥后不得超过1h就加入检验用培养基具抑菌活性的供试品 当供试品具有抑菌活性时，应将供试液中的抑菌活性消除后，方能依法检查。常用的方法有：n 稀释法降低供试品的相对浓度n 薄膜法利用体积差异分离n 中和法利用化学（生物）专属性灭活n 离心法利用沉降系数差异分离一、微生物限度检查法验证 对药品进行微生物限度检查法时，首先应进行检测方法的验证。如细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认该计数方法是否科学、准确、客观。若供试品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，计数方法应重新验证。验证时，按供试液的制备，细菌、霉菌和酵母菌计数所规定的方法及下列要求进行。对各试验菌的回收率应逐一进行验证。 验证用菌株及菌液的制备菌株 大肠埃希菌CMCC（B）44102、金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003、 枯草芽孢杆菌、CMCC（B）63501白色念株菌CMCC (F) 98001、 黑曲霉菌CMCC(F)98003 。菌液制备 大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌接种营养肉汤，白色念株菌接种真菌培养基、黑曲霉接种真菌培养基斜面，置规定温度、时间，培养。取培养物用0.9%无菌氯化钠溶液稀释成1ml含50100cfu的菌液。 验证方法 试验组 取规定量最低稀释级的供试液1ml，和50100cfu试验菌，每株菌做2个平板，按平板菌落计数方法测定其菌数。采用薄膜过滤法计数时，最后一次冲洗液中加入50-100cfu，过滤，培养，计数。菌液组 测定加入的试验菌液的菌数。供试品对照组 取规定量的供试液，按平板法测定供试品稀释液本底的菌数。稀释剂对照组 取稀释液，加入试验菌，使菌浓度为每1ml 供试液含50100cfu，按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。验证试验应独立平行进行3次，分别计算各次试验菌的回收率。 试验组的菌回收率=（试验组平均菌落数供试品对照组平均菌落数）/菌液组平均菌落数 100%稀释剂对照组的菌回收率=（稀释剂对照组的平均菌落数/菌液组的平均菌落数）100%结果判断 在三次平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率应大于70%。若试验组的菌回收率均大于70%，符合验证试验，可按此方法测定细菌、霉菌和酵母菌数；若任一次平行试验中试验组的菌回收率均小于70%，不符号验证试验，应采用培养基稀释法、离心集菌法、过滤法、中和法等方法或这些方法联合使用消除供试品抑菌活性，并重新验证。验证试验可与供试品的细菌、霉菌及酵母菌计数同时进行。二、检查法阴性对照试验 ：取试验用的稀释剂1ml，于无菌平皿中，注培养基，凝固，培养。每种计数培养基各做2个平板，均不得长菌。在特殊情况下，营养琼脂培养基上长霉菌、酵母菌或玫瑰红钠琼脂培养基上长细菌，则应分别点计霉菌、酵母菌、细菌菌落数，以菌落数高的培养基中的菌数为计数结果报告。菌数报告规则：l 宜选取细菌、酵母菌平均菌落数在30300之间，霉菌平均菌落数在30100之间的稀释级，作为菌数报告。l 当仅有1个稀释级的菌落数符合上述规定，以该级的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。l 当同时有2个稀释级的菌落数符合上述规定时，视两者比值（比值为高稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值除以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值）而定。若比值不大于2，以两稀释级的菌落数乘以稀释倍数的均值报告菌数；若比值大于2但不超过5时，以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。当出现比值大于5，或高稀释级的菌落数大于或等于低稀释级的菌落数等异常情况时，应查明原因再行检查，必要时，应进行方法的重新验证。l 当各稀释级的平均菌落数均小于30，以最低稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。l 各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于1时，以1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。三、控制菌检查控制菌检查法的验证试验菌株：按规定检查的控制菌选择相应验证的菌株。阴性对照菌株:选择原则，口服局部用控制菌。菌种的要求：不得超过5代（从菌种保藏中心获得的冷冻干燥的菌种为第0代）。加菌量:50100cfu。控制菌检查法验证的方法l 验证试验按供试液的制备和控制菌检查法的规定及下列要求进行。l 验证试验可与供试品的控制菌检查同时进行。 l 试验组：取规定量供试液及50100cfu试验菌加入增菌培养基中，依相应控制菌检查法进行检查。当采用薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，试验菌应加在最后一次冲洗液中，过滤后，注入培养基或取出滤膜接入增菌培养基中。l 阴性菌对照组：设立阴性菌对照组是为了验证该控制菌检查方法的特异性，方法同试验组检出。 控制菌检查法的验证-结果判断阴性菌对照组不得检出阴性对照菌。若试验组检出试验菌，按此供试液置制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查。试验组未检出试验菌，应采用稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新验证。四、检查法：阳性对照试验：阳性对照试验的加菌量为50100cfu，方法同供试品的控制菌检查。阳性对照试验检出相应的控制菌。阴性对照试验：阴性对照试验应无菌生长，如大肠埃希菌检查取供试液10ml . 接种至处理后的适量胆盐乳糖培养基中 培养1824 取培养物0.2ml 接种至含5mlMUG培养基的试管内 于24h紫外线下观察，同时用未接种的MUG培养基作本底对照。观察结果：管内培养物呈现荧光，为MUG阳性；不呈现荧光，为MUG阴性。沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性，呈试剂本色，为靛基质阴性。本底对照应为MUG阴性和靛基质阴性。注意事项：1. 对于同一份培养物，采用相同的测定方法，不同的实验人员的测定结果的可能有很大的误差，甚至达到50%。所以，在操作过程中，应特别注意能造成误差的各个环节。2. 供试液制备： 供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。 供试液制备若需用水浴加温时，温度不应超过45。 供试液的体积：100ml。 3.细菌、霉菌及酵母菌计数l 计数方法：平皿法、薄膜过滤法l 供试液取样：混悬液、上清液。l 培养时间必要时，可适当延长培养时间至57天 l 同稀释级两个平板的菌落平均数不小于15时，则两个平板菌落数不能相差1倍或以上。l 菌数报告规则：如各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于1时，以1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。4. 当采用固体培养基上的培养物制备菌悬液时，应尽量使菌苔成单个菌体充分分散于稀释液中，一般将菌苔与微量稀释液先在管壁上混匀。对于那些不易制成均匀菌悬液的菌苔（如枯草芽孢杆菌），一般采用液体培养物制备菌悬液。若液体培养物产生菌膜，取菌液时应避免取出菌膜，一般应取培养管中部的均匀菌悬液。 5. 为保证每次菌数测定能在预计的范围内，在对菌液做10倍系列稀释时，要求稀释每个浓度的菌液均应换灭菌吸管。操作时，将灭菌吸管插入原液中，将菌液充分混匀，吸取菌液，贴于试管内壁调整液量至刻度，将菌液移入下一级的稀释管中，移入时，吸管应接