LiCl对IDH2突变的神经胶质瘤细胞增殖及迁移影响的研究

LiCl 对对 IDH2 突变的神经胶质瘤细胞增殖及迁移影响的研究突变的神经胶质瘤细胞增殖及迁移影响的研究 摘要 神经胶质瘤是颅内常见的恶性肿瘤 具有发病率 复发率 死亡率高和治愈率低的 三高一低 的特点 依照 WHO 组织病理学和 临床标准 人类大脑神经胶质瘤分为 I IV 级 WHOIV 级被认为是神经 胶质母细胞瘤 在成年人群中 是主要盛行和恶性的原始大脑肿瘤 异 柠檬酸脱氢酶 isocitratedehydrogenase IDH 是一类酶家族 在人基因组 中 有 5 类 IDH 基因可编码 3 类异柠檬酸脱氢酶 IDH1 IDH2 和 IDH3 均可催化异柠檬酸 ICT 生成还原性辅酶 NADPH 和 酮戊二 酸 KG 研究发现 IDH1 R132 突变在继发性胶质母细胞瘤和低级 别神经胶质瘤中发生率较高 IDH2 R172 突变则较低 IDH1 和 IDH2 突变都是单一位点的氨基酸突变 IDH1 突变后其催化活性降低 相 对应的酶促反应产物 NADPH 和 KG 的产量下降 但同时又使其获 得了一种新的酶促活性 催化 NADPH 和 a KG 生成 2 HG IDH 突变 后 细胞内 HIF 1 稳定性提高 进而调节其下游靶基因的表达 促进肿 瘤细胞的生长 当前 肿瘤细胞内微环境是癌症研究领域的核心问题 对肿瘤生长 迁移的生物学机制的正确理解 有助于为针对神经胶质 瘤的增殖和迁移相关信号分子的靶向药物的设计和筛选提供理论和 实验依据 本课题拟在前期工作和思路的基础上 探讨在 IDH 突变的 真实细胞内环境下 氯化锂在调节神经胶质瘤中与增殖和迁移相关的 信号分子的作用机制 本实验首先将穿梭质粒 pEGFP N1 重组质 粒 pEGFP N1 IDH2R172G 和 pEGFP N1 IDH2 转染大鼠神经胶质瘤 C6 细胞株 通过 WesternBlot 实验检测细胞内低氧诱导因子 HIF 1 细胞周期蛋白 CyclinD1 血管内皮生长因子 VEGF 和 M2 型丙酮 酸激酶 M2 PK 的蛋白表达水平 利用明胶酶谱实验 对基质金属蛋白 酶 2 9 MMP 2 9 的分泌水平进行检测 实验结果表明 IDH2 突变可 提高细胞内 HIF 1a 稳定性 CyclinD1 VEGF MMP 2 9 M2 PK 的 表达量明显提高 说明 IDH2 突变后 酶活性下降 导致催化产物 KG 量减少 HIF 1 稳定性提高 进而引起 HIF 1 的下游靶基因 CyclinD1 VEGF MMP 2 9 的表达量提高 体外划痕擦伤实验结 果表明 在 pEGFP N1 IDH2R172G 处理组中 划痕两侧细胞向划痕中 央生长的速度较 pEGFP N1 和 pEGFP N1 IDH2 处理组快 LiCl 是 应用在治疗抑郁症和极端情绪方面重要的药物 可抑制肌糖单磷酸酶 和糖原合酶激酶 3 GSK 3 活性 GSK 3 是在所有真核细胞中发现的 一种多功能的丝氨酸 苏氨酸蛋白激酶 可以调节许多过程 包括新陈 代谢 细胞分化和死亡等 LY294002 可通过抑制 Akt 磷酸化等来抑 制 PI3K Akt 信号途径 从而使 GSK 3 磷酸化水平降低 活性提高 本研究利用 LiCl 和 LY294002 对细胞内 GSK 3 的磷酸化水平进行 调节 分析细胞内 GSK 3 的磷酸化水平对 IDH2 突变的 C6 细胞株增 殖活力的影响 WesternBlot 实验结果表明 LY294002 可以降低 GSK 3 的磷酸化水平 而 LiCl 不能再提高已经被 LY294002 处理过 的 C6 细胞内的 GSK 3p 的磷酸化水平 MTT 实验结果表明 LY294002 可以抑制细胞的增殖活性 并且 pEGFP Nl IDH2 组的抑制 率总是高于 pEGFP N1 组和 pEGFP N1 IDH2R172G 组 而 LiCl 对 LY294002 处理之后的 C6 细胞的增殖活性没有影响 接着 本实验分 析了 LiCl 对 IDH2 突变的 C6 细胞迁移和增殖的影响 MTT 实验结果 表明 锂离子可以降低细胞的增殖活性 推测是由于锂离子抑制 GSK 3 的活性之后 导致细胞内糖代谢发生紊乱 诱导了细胞的凋亡 在 C6 细胞中 无论 IDH2 是否发生突变 锂离子均可以导致 HIF 1 的稳 定性降低 从而使 C6 细胞的增殖能力受到抑制 并且在野生型 IDH2 处理组中 HIF 1 稳定性降低的程度高 在对照组 EGFP 和野生型 IDH2 处理组中 LiCl 可使 catenin 核积累量提高 但在突变型 IDH2 处理组中 catenin 核积累量却降低 通过明胶酶谱实验表明 在 pEGFP N1 IDH2R172G 处理组中 MMP 2 和 MMP 9 分泌水平提高的 程度不如 pEGFP N1 和 pEGFP N1 IDH2 处理组中高 说明 MMP 2 和 MMP 9 分泌水平的提高还是由于 IDH2 突变的原因 Wnt catenin 信号通路只是起到了比较微弱的作用 本研究工作试图揭示 LiCl 对 IDH 突变的神经胶质瘤细胞中相关信号通路分子调节作用 确定其抑 制肿瘤细胞增殖和迁移的分子机制 进一步充实对目前有关 IDH 突变 与神经胶质瘤生长和迁移关系的研究 关键词 神经胶质瘤异柠 檬酸脱氢酶 2 氯化锂迁移增殖 学位授予单位 山西大学 学位级别 硕士 学位授予年份 2013 分类号 R739 41 目录 中文摘要 12 14ABSTRACT14 17 第一章文献综述 17 271 1 异柠檬酸脱氢酶 isocitratedehydrogenase IDH 突变对胶质瘤细 胞中 HIF 1 的影响 17 191 1 1 神经胶质瘤 171 1 2IDH 突变的特点以 及对 HIF 1 的影响 17 191 2HIF 1 对下游靶基因 MMPs VEGF 和 CyclinD1 表达的影响 19 211 3LiCl 对肿瘤细胞中 Wnt catenin 及其 他通路的调控作用 21 221 4 研究 LiCl 与 IDH 突变之间的关系和意 义 22 231 5 论文设计思路 23 271 5 1 研究背景 23 241 5 2 实验目的 和主要研究内容 241 5 3 实验方案及流程 24 261 5 4 研究的创新点 26 27 第二章 C6 细胞中 IDH2 突变对其迁移和增殖的影响 27 412 1 实验材料 27 292 1 1 细胞和质粒 272 1 2 酶和生化试剂 27 282 1 3 试 剂的配制 28 292 1 4 实验仪器 292 2 实验方法 29 332 2 1 细胞培养 29 302 2 2 三种质粒转染 C6 细胞 302 2 3 三种质粒转染 C6 细胞后细 胞内 HIF 1 CyclinD1 M2 PK 以及培养基内 VEGF 的表达水平分 析 30 322 2 4 免疫荧光检测实验 322 2 5 明胶酶谱实验 32 332 2 6 体 外划痕擦伤实验 332 3 实验结果 33 392 3 1 三种质粒转染 C6 细胞后 细胞内 HIF 1 CyclinD1 M2 PK 以及培养基内 VEGF 的水平变化 33 352 3 2C6 细胞内 HIF 1 和 VEGF 的免疫荧光检测结果 35 362 3 3 明胶酶谱检测 C6 细胞内 MMP 2 9 的分泌水平 36 382 3 4 体 外划痕擦伤检测 C6 细胞的迁移能力 38 392 4 讨论 39 41 第三章 GSK 3 的磷酸化对 IDH2 突变的 C6 细胞增殖活性的影响 41 483 1 实验材料 41 423 1 1 细胞和质粒 413 1 2 酶和生化试剂 413 1 3 试剂 的配制 41 423 1 4 实验仪器 423 2 实验方法 42 433 2 1 细胞培养 423 2 2 三种质粒转染 C6 细胞 423 2 3LiCl 处理细胞 423 2 4LY294002 处理细胞 423 2 5LiCl 和 LY294002 作用分别转染 三种质粒的 C6 细胞后细胞内 GSK 3 的磷酸化水平分析 423 2 6LY294002 作用分别转染三种质粒的 C6 细胞后对细胞增殖活 力的影响 42 433 2 7LY294002 和 LiCl 先后作用分别转染三种质粒的 C6 细胞后对细胞增殖活力的影响 433 3 实验结果 43 463 3 1LiCl 作 用分别转染三种质粒的 C6 细胞后细胞内 GSK 3 的磷酸化水平变化 43 443 3 2LY294002 作用分别转染三种质粒的 C6 细胞后细胞内 GSK 3 的磷酸化水平变化 443 3 3LY294002 和 LiCl 先后作用分别 转染三种质粒的 C6 细胞后细胞内 GSK 3 的磷酸化水平变化 44 453 3 4LY294002 作用分别转染三种质粒的 C6 细胞后对细胞增殖活 力的影响 45 463 3 5LY294002 和 LiCl 先后作用分别转染三种质粒的 C6 细胞后对细胞增殖活力的影响 463 4 讨论 46 48 第四章 LiCl 对 IDH2 突变的 C6 细胞迁移和增殖的影响 48 564 1 实验材料 48 494 1 1 细胞和质粒 484 1 2 酶和生化试剂 484 1 3 试剂的配制 48 494 1 4 实验仪器 494 2 实验方法 49 514 2 1 细胞培养 494 2 2 三种质 粒转染 C6 细胞 494 2 3LiCl 处理细胞 494 2 4LiCl 作用分别转染三种 质粒的 C6 细胞后对细胞增殖活力的影响 494 2 5 明胶酶谱实验 49 504 2 6 体外划痕擦伤实验 504 2 7LiCl 作用分别转染三种质粒的 C6 细胞后细胞内 HIF 1 的表达水平分析和 catenin 的核积累量的分 析 50 514 3 实验结果 51 544 3 1LiCl 作用分别转染三种质粒的 C6 细 胞后对细胞增殖活力的影响 514 3 2 明胶酶谱检测 C6 细胞内