PCR测序等临床应用

分子诊断技术在临床上的应用,吉林大学中日联谊医院中心研究室 吴晓冬,分子生物学诊断的对象及在诊断中的位置 转录 翻译 分泌和表达 DNA 核膜 蛋白 细胞膜 临床表现 mRNA 功能性产物 核酸诊断 生化诊断 血清学诊断 临床诊断 （基因诊断） （酶法测定） （血清蛋白）,新技术在临床诊断上的应用：一、聚合酶链反应二、组织配型技术三、荧光原位杂交技术（）四、STR技术五、单核苷酸多态性(SNP)六、测序技术七、基因芯片技术等,PCR技术在临床检验中的应用,PCR的原理,链式反应的雪崩效应,典型的PCR操作,（1）向一微量离心管中依次加入： 10PCR缓冲液 110体积 dNTP各 200umol L 引物各 lumol L DNA模板102105拷贝 ddH2O补至终体积（终体积50100ul） 混匀后，离心15s使反应成分集于管底。（2）加入l5U Taq DNA聚合酶（3）变性-退火-延伸，重复2530次。再72延伸 10min。（4）凝胶电泳，观察结果。,模板DNA样品的处理,一、细菌和病毒标本的制备（）细菌标本（二）病毒标本的处理二、血液细胞标本的制备三、临床拭子标本的处理,PCR技术的分类,免疫PCR（ImmunoPCR，I-PCR） 套式引物PCR（Nested primer PCR）反转录 PCR（Reverse transcription PCR， RT-PCR） 反向PCR（Reverse PCR） 标记PCR（Labelled primers PCR） 不对称PCR（Asymmetric PCR） 玻片PCR（SlidePCR） 定量PCR 锚定PCR（Anchored PCR）,免疫PCR（I-PCR）,免疫PCR是指用DNA分子作为标记物，在做一般的免疫反应的同时进行 PCR扩增和电泳分析的免疫实验抗原一抗体一亲和素一生物素一DNA复合物 此法把 PCR惊人的扩增能力与抗原抗体反应的特异性结合在一起，从而极大地提高了检测抗原的灵敏度,套式引物PCR（Nested PCR）,套式引物PCR是指先后用两套引物进行扩增的 PCR技术。通常先用第一套引物扩增1530个循环，再用已扩增的DNA片段内设定的第二套引物扩增1530个循环。采用套式引物PCR，既可增加反应的特异性，又可得到丰产的特异性靶序列，增加敏感性。套式引物PCR技术对环境样品中微生物的检测和单拷贝基因靶DNA的扩增是非常有效的。,反转录 PCR(RT-PCR),反向PCR (Reverse PCR),反向PCR是指用反向的互补引物来扩增两引物以外的 DNA片段，其目的是扩增一段已知序列旁侧的DNA。 也就是说，这一反应体系不是在一对引物之间而是在引物外侧合成DNA。,不对称PCR（Asymmetric PCR）,不对称PCR是指用不等量的一对引物来产生大量的单链DNA（ssDNA）的PCR方法。不对称PCR主要为测序制备ssDNA，其优点不必在测序之前除去剩余引物，因为量很少的限制性引物已经耗尽。,定量PCR,DNA-PCR定量mRNA-PCR定量,锚定PCR（Anchored PCR）,要扩增的DNA序列，只有一端是已知的，而另一端是未知的，在一条未知的DNA序列末端加上一个已知的“尾巴”，再通过扩增而进行鉴定的PCR法。,PCR技术在医学上的应用,病原体的检测基因遗传病的诊断肿瘤基因的检测和诊断 法医学研究,病原体的检测,人类免疫缺陷病毒（HIV）乙肝病毒(HBV)及其分型丙肝病毒（HCV）与戊肝病毒（HEV）人乳头瘤病毒（HPV） 及其分型结核杆菌其它病原微生物:脑膜炎双球菌、淋球菌、寄生虫 等,常见的传染性疾病有细菌、病毒、衣原体、支原体等，可引起消化、呼吸、循环、泌尿生殖等不同系统相应的病变。 我国是乙肝高发区，乙肝病毒经血液传播，病毒主要在肝细胞中增殖，也可以长期存留在骨髓细胞或外周血白细胞中。故通常用PCR法检测血清中的乙肝病毒。有报道用PCR法可以在泪液、乳汁、精液及血白细胞中检出乙肝病毒，这些发现提示其他传染途径存在的可能。,病原体的检测,PCR方法检测乙肝的优势：1 早期诊断 敏感 可在感染潜伏期检出2 对低持续感染乙肝病人的诊断3 疗效跟踪及病程判断,病原体的检测,丙肝病毒是RNA病毒，丙肝病毒的分离尚未成功，目前用于丙肝病毒检验的方法主要是ELISA法测定血清中的HCV抗体。由于包被的抗原是人工合成的，与天然病毒抗原有一定的区别，理论上是存在假阳性和假阴性的。RT-PCR技术使这些困难得到解决。,病原体的检测,在消化道传染性疾病中，另一类最重要的感染性疾病是幽门螺旋杆菌所引起的胃炎、胃溃疡等。幽门螺旋杆菌是通过口-口途径传播并定位于胃黏膜上皮细胞。故通过PCR法检测HP非常敏感且特异性高，有研究发现可以从病人的唾液或口腔含漱液中检出，减少病人的痛苦。,病原体的检测,呼吸系统感染性疾病：肺结核、非典型性肺炎等。 结核检测的金标准是结核菌培养法。但培养法费时昂贵并且受到用药的影响，在实际应用上受到限制。 PCR法简便、敏感、特异。一般认为样本中只要有100个左右的结核菌即可被检出。,病原体的检测,循环系统以肠道小RNA病毒感染最具代表性。如柯萨奇病毒等。RT-PCR检测，应注意标本的保存。 外在环境富存大量RNA酶，病毒脱壳后RNA将被迅速降解。一般用于RNA检测的血清常温下不应超过24小时，4可保存2天，-20下可以保存2月以下。,病原体的检测,性病诊断中应用广泛 淋病双球菌、解脲衣原体、沙眼衣原体、梅毒螺旋体等用PCR方法诊断。,病原体的检测,PCR及其相关技术在遗传性疾病诊断中的应用 遗传性疾病根据其遗传方式可分为单基因、多基因和染色体遗传病。常用诊断方法有家系谱分析、染色体检查、生物化学分析等。PCR在遗传病诊断应用中，可利用引物直接扩增变化的基因产物，也可以结合应用限制性内切酶，分子杂交及电泳图谱分析进行诊断。应用较广泛的有地中海贫血、苯丙酮尿症、血友病及性别鉴定等。,地中海贫血：是世界上最常见的单基因遗传病，在我国发病率为0.66%，广州、广西等地高发可达10%。应用PCR技术可直接检测突变的基因诊断此病。 苯丙酮尿症：是一种常染色体隐性遗传病，病人肝脏苯丙氨酸羟化酶严重缺乏使苯丙氨酸不能转化，出现脑组织损伤，智力障碍。本病患者应低苯丙氨酸饮食治疗，但非常昂贵，关键应避免出生。故早期诊断极其重要。,PCR及其相关技术在遗传性疾病诊断中的应用,镰形细胞贫血 由于基因突变而引起Hb的结构异常，正常人Hb的珠蛋白链第6位上谷氨酸被缬氨酸代替而形成血红蛋白S(HbS)所致。 Chehab等设计一对引物把含有突变的DNA片段扩增，扩增产物用限制性内切酶消化，琼脂糖凝胶电泳后染色观察：正常人有2个片段，191和103bp，镰形细胞贫血的纯合子，仅有一个片段294bp，杂合子有191、 103和294bp 3个片段。,PCR及其相关技术在遗传性疾病诊断中的应用,杜氏营养不良症（DMD）,DMD是一种男性常见的性连锁致死性遗传病（X性连锁遗传症）。60的DMD患者存在着dystrophin基因缺失。该方法简单、快速，便于临床使用。,PCR及其相关技术在遗传性疾病诊断中的应用,甲型血友病是最常见的遗传性凝血功能障碍所致的出血性疾病，为X性连锁隐性遗传（女性传递，男性发病），在男性中发病率为万分之一。 另外，对于有遗传倾向的疾病，尤其是老年性疾病，如糖尿病、高血压、一些肿瘤疾病，也是当前研究的热点及难点，可望近期有所突破。,PCR及其相关技术在遗传性疾病诊断中的应用,肿瘤基因的检测和诊断,恶性肿瘤分子标记的检测：如慢性粒细胞性白血病(CML）。CML的费城染色体(即ph染色体）是标记染色体; 融合基因BCR-ABL的检测癌基因、抗癌基因缺失与点突变研究 肿瘤相关病毒基因的研究： HBV与原发性肝癌；EBV与鼻咽癌、何杰金氏病等有关；近年来用PCR技术在宫颈癌、前列腺癌、肠癌和Kaposi肉癌等组织中均检出有HCMV DNA顺序，提示 HCMV具有潜在的致癌性。,原癌基因存在于正常细胞中，并表达生物功能，只有在原癌基因被激活后才能诱导细胞转化，可能的原癌基因活化机理：1 点突变 受到射线、化学因素、生物因素的诱导。2 获得启动子 原癌基因从病毒基因中获得启动子而活化。3 基因易位 内外界因素能导致染色体的某些基因易位、重排使原来无活性的原癌基因移至某些强的启动因子或增强子附近而被活化4 原癌基因的过量扩增,随着分子肿瘤学研究的发展，目前已能从基因水平对癌症进行诊断，也能通过检测与癌变有关的基因标志物来判定组织学的良、恶性程度，癌的进展以及肿瘤的耐药性。肿瘤的基因诊断主要是通过检测肿瘤基因标志的变化来实现的。,（一）常见的肿瘤基因标志物及其与肿瘤的关系1. K-ras基因 是位于染色体12p12.1上的编码21kD（p21）蛋白的编码基因。P21的活化在传达细胞外源性增殖信号中具有重要的作用，变异型p21与正常型p21相比其GPT酶活性明显下降，认为与癌变有关。K-ras基因的点突变主要集中在特定的氨基酸密码子（第12，13，61）上，而这种异常以大肠癌、胰腺癌、肺癌等发生率较高，在胰腺癌中，K-ras基因的点突变发生率高达90%，且大部分局限于密码子12上。大量的研究表明，变异型K-ras基因阳性，即使病理组织学诊断淋巴结转移阴性，癌症复发的可能性也很高，因此，K-ras基因点突检测不仅对肿瘤的诊断而且对其预后判断都有一定的价值。,2. p53基因 是一种抑癌基因，是目前人类肿瘤中最常发生变化的基因。它位于染色体17p13.1上，编码53KD的核磷酸蛋白，此蛋白通过p21蛋白参与细胞周期的调控，对细胞的分裂和增殖起负调节作用，若突变，则最终使细胞生长和分化的调节失控，导致细胞的持续分裂和癌变。 在许多恶性肿瘤中均发现有p53基因的异常，肺癌为50%-70%，膀胱癌约为60%，胰腺癌为70%-80%，在肝癌和子宫内膜癌中也有较高的发生率。针对大肠肿瘤的研究表明，p53的杂合性丢失频度在大肠腺瘤中为20%，而在大肠癌中则为85%-95%，提示p53基因的异常可能与腺瘤的癌变有关。,3. DCC基因 是位于染色体18q21.3上的抑癌基因。肿瘤组织，DCC基因的杂合性丢失和DCC mRNA表达低下在胃癌，大肠癌中呈现较高的频率，特别是在肝转移的病例中，提示它可能作为肝转移的一个诊断标志。,4. 微卫星DNA 在人类基因组中有许多CA、GT等散在的2-4个碱基对的单纯反复排列，称为微卫星。有关它的功能还不明了。据报道，在家族性非息肉性大肠癌中以及散在性大肠癌中有高比率的微卫星反复排列数量的异常。,5. 端粒酶 位于染色体末端的端粒在人体中是由T、T、A、G、G、G6个碱基构成一个单位，在生殖细胞中以长约20kb，体细胞中以6-10kb的长度进行反复排列，通常认为端粒与染色体的稳定性有关，其长度随着细胞的反复分裂而缩短，缩短到一定程度细胞再分裂，也就是说，细胞分裂的寿命取决于端粒的长度。在癌细胞中存在有延长端粒的酶。胃癌、大肠癌、肾癌、前列腺癌等端粒酶表现为高度的活性。除了表达异常外，端粒的微小缺失和易位也与肿瘤的发生有着密切的关系。,6. p16基因 p16基因定位于9p21上，全长8.5kb，由2个内含子间隔3个外显子组成，它是细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子，参与细胞周期的调节，与肿瘤的发生有着密切的关系。 P16基因纯合缺失常见于各种肿瘤。不同的肿瘤其纯合缺失的百分率各不上同，以食道癌最高，约92.3%。在急性淋巴细胞性白血病中40%存在p16纯合缺失，其他肿瘤p16基因纯合缺失的百分率分别为恶性间皮瘤61.9%，胰腺癌40.5%，卵巢癌22%。 P16基因突变与肿瘤的发生也有着密切的关系。据报道，在肺癌中14/27例存在p16基因突变且都导致编码的氨基酸序列改变，在18个家族性黑色素瘤家系中，13个家系存在着8种p16基因突变型。,（二）、肿瘤基因诊断的评价 肿瘤的发生、发展是一个复杂的多因子协同的过程，包括启动（最初细胞伤害）、进展（形成肿瘤）及扩散（恶性程度进一步增高）等，在许多情况下，单个癌基因结构、功能变化不足以引起恶变；而2个或多个癌基因间的相互协同作用，是维持某些细胞的恶性类型所不可缺少的。 某一肿瘤基因标志物阳性结果只能单纯提示肿瘤DNA的存在，并不能代表活的癌细胞的存在。一般情况下肿瘤基因标志物变化的检测只能是一种临床诊断和预后判定的辅助手段，但也有一些癌基因遗传学变化的检测已达到确认某些肿瘤的程度，例如慢性骨髓性白血病患者几乎都可检测到原癌基因易位导致的BCR/ABL融合基因形成。,法医学研究,利用罪犯在犯罪现场留下的任何少量标本，如一根毛发、一滴血液、极小的血斑和精斑等其它分泌物或组织块等进行PCR扩增，结合指纹图谱等分析可进行个体识别、亲子鉴定、性别鉴定等。,PCR技术存在的主要问题及解决的办法,复制的不忠实性 一般而言，即使每100个碱基中出现一个错误碱基，在大多数的诊断应用中也不会造成很大的影响，即不影响对结果的解释。但若用PCR的扩增产物来进行分子克隆时，会造成严重的错误结果。 克服上述错误复制的主要办法是： 1、适当增加引物的长度和模板DNA的数量； 2、选择合适的反应温度和条件； 3、选购优良的DNA聚合酶； 4、适当提高退火和引物延伸的温度等。,污染性假阳性1、尽量减少PCR循环的次数，以扩增产物 达到能够检测水平为目的；2、严格隔离PCR样品制备和产物；3、处理检测样品时也要注意克服彼此间的污染，尽量使用一次性器具；4、分装和预混试剂，减少重复加样次数；5、操作者应带手套，加样时要格外小心，避免样品外溢和外来的DNA进入；6、试剂管用前先瞬时离心（10s），使液体沉于管底，减少污染手套与加样器机会。,7、最后加模板DNA（包括在石蜡油后），马上盖好，混匀，瞬时离心（10s）。 8、加入样品之前，可用紫外线照射孵育液，借以灭活其中可能含有的外来DNA，或在加入样品和Taq DNA聚合酶之前，先加入DNA酶，用以降解可能被污染的外源性DNA； 9、设立适当的阳性对照，应包括空白对照（不加样品 DNA），引物对照（以引物代替模板DNA），阴性对照（加入不含待扩序列的DNA）； 10、阳性对照应与待检样品分开操作。,非特异性扩增是指引物与不完全互补的DNA序列结合而引起的扩增。这种情况的出现可能与镁离子浓度、退火温度以及引物设计长度等有关。检验扩增产物是否有非特异性出现时，可通过电泳观察PCR扩增片段长度、Southern杂交和用合适的限制性内切酶酶切等。克服非特异性扩增的主要办法是：调整镁离子浓度、退火温度和修改引物等。,实验室布局要合理，防止空气污染。常规实验室必须在三个分开的房间进行分阶段操作，第一间实验室作为混合试剂和质控；第二间实验室用于标本提取和试剂混合；第三间实验室用于PCR扩增及产物检测，工作人员应从第一间依次到第三间实验室，不能返回工作。室内空气流向从第一间依次到第三间实验室，不能逆流。,骨髓与器官移植,一、 概 述,人们早就发现，在人群或同一种动物不同个体之间进行组织移植，移植物终将被排斥脱落。引起这种移植排斥反应现象的抗原叫做移植抗原或称组织相容性抗原。在引起移植排斥反应中起主要作用的称为主要组织相容性抗原系统 ，基因包括几个不同的位点，称为主要组织相容性复合体(MHC)。人类MHC称为HLA系统 。,二、 人类MHCHLA系统 HLA基因位点及产物,人类MHCHLA系统是一组编码B、T淋巴细胞和抗原提呈细胞(APC)等有核细胞表面蛋白分子（抗原）、高度密集、紧密连锁的基因群。位于第6号染色体短臂上的一段DNA区域，包括多个编码细胞膜组织相容性的、类基因位点以及与补体有关的类基因位点。类抗原：HLA-A，HLA-B，HLA-C；类抗原：HLA-D，HLA-DR，HLA-DQ，HLA-DP；类抗原：C4A，C4B，C2，Bf等补体成分。,HLA基因位点及产物,HLA位点具有众多的等位基因，形成HLA的极端多态性。 目前已检测出的等位基因及其产物， A位点为23个；B位点为49个； C位点为13个；D位点为23个； DR位点为14个；DQ位点为7个； DP位点为6个。,HLA的多态性及其遗传,正常情况下，人体细胞是二倍体型的。染色体上HLA各位点的等位基因全部为共显性的。由于在一条染色体上HLA各位点之间距离非常近，因此HLA常作为一个整体遗传给子代。在一条染色体上HLA各位点的基因组合称HLA单倍体型(Haplotype)，如：A1，B8，DR3。,在细胞膜上能检测出的抗原特异性，则称为表现型(Phenotype)，如：A1，A3，B7，B8，DR2，DR3。两个同源单倍体型构成HLA的基因型 (Genotype):如A1，B8，DR3（父亲），A3，B7，DR2（母亲）。两条染色体，一条来自父亲，一条来自母亲。每个位点含有两个等位基因，一个来自父亲，一个来自母亲。一般来说，两个同胞之间具有相同基因型的机会为25%；两个单倍体型完全不同的占25%；一个单倍体型相同的是50%。,HLA的主要应用,HLA与器官移植HLA与临床疾病 如HLA-B27与强直性脊柱炎 B8、DR3与重症肌无力 DR2、DR7与多发性硬化症HLA与人类学的研究HLA与亲子鉴定,二、 人类MHCHLA系统 HLA的主要应用,1. HLA与器官移植 HLA组织配型在60年代开始临床应用，器官移植的存活率和器官移植的数目均明显增高。肾移植受者与供者HLA-A、HLA-B、DR三个位点抗原相同与否器官存活率的差别：第一年12%，第三年为19%，第十年为33%。 尤其是DRB1的相配，可以提高一年存活率610%，510年存活率1025，提高半寿期一倍以上。,二、 人类MHCHLA系统 HLA的主要应用,2. HLA与临床疾病 HLA抗原特异性与许多疾病有关， 95%的强直性脊柱炎患者具有HLA-B27抗原。 DR2与嗜眠症，B8、DR3与重症肌无力，DR2、DR7与多发性硬化症，B8与疱疹皮肤病，DR3、DR9与胰岛素依赖性糖尿病等。 甲亢与B8、DR3、B35有关。最新研究表明，具有HLA-A1、B8单倍型者，感染HIV病毒后可迅速发展为艾滋病。,二、 人类MHCHLA系统 HLA的主要应用,3. HLA与人类学的研究 HLA抗原频率的分布可反应人群的迁移史。如南美印第安人无HLA-27抗原，而北美印第安人和爱斯基摩人却有很高的B27抗原频率。依此推测北美印第安人是由亚洲不同地区人群经多代移居北美所组成。欧洲白种人也不是同源人群。北欧人DR5的频率为5%，而南欧人的DR5的频率却为15%。,二、 人类MHCHLA系统 HLA的主要应用,4. HLA与亲子鉴定 HLA系统具有高度多态性，如果只考虑HLA-A位点上20个抗原、B位点上51个抗原和DR位点上14个抗原，按相关公式计算:21+(21-1)(21-2)/252+(51-1)(52-2)/2 15+(15-1)(15-2)/2，将有三千万种表现型。因此在亲子鉴定中的作用远远大于血型基因鉴定。,器官和骨髓移植检查项目的选择和应用1、ABO血型配型2、HLA配型3、DNA分型 不同的器官移植对HLA相容性的要求不同，骨髓、肾移植要求最严格。,HLA配型的临床意义 对急性排斥反应和激素冲击治疗的影响,移植排斥反应的本质是一种免疫反应， 从移植免疫学角度选择理想的供体和应用强有力的免疫抑制剂是目前控制排斥反应的主要措施。良好的配型对于减少移植排斥和激素冲击次数，提高存活率，在CsA（环孢素）前的年代具有非常重要的作风，在 CsA应用十年后的今天仍然具有重要价值。,HLA配型的临床意义 对移植物存活的影响,对40个国家279个移植中心3万多例首次移植患者连续5年以上随访资料显示：随着HLA-A、B、DR六抗原不配数目的增加，其存活率明显下降，均具有极其显著性差异(P0.0001)。无论短期存活还是长期存活都具有显著性差异，大量临床回顾性资料可见在环孢素时代的器官移植供受者之间HLA的相容程度仍然是影响移植物存活的主要因素。,HLA配型的临床意义 对再次移植和高危组受者的影响,由于种族间遗传学的差异，在世界范围内的供肾严重不足， 临床上将黑人受者和接受高危供肾的病人统称为高危病人，和再次移植的病人一样，是临床上并发症较多，存活率较低的患者。研究显示，HLA配型对这部分高危病人具有特别重要的意义。 综合分析HLA-A、B、DR相配组再次移植受者2年GS为82%，而错配组仅为49%。,SNP技术的发展与应用,SNP是Single Nucleotide Polymorphism的缩写，即单核苷酸多态性。 SNP主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。占所有已知多态性的90%以上。 SNP在人类基因组中广泛存在，平均每1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。,什么是单核苷酸多态性,人类999的基因密码是相同的，而差异不到01，不同人群仅有140万个核苷酸差异。这些差异是由“单一核苷酸多样性”（SNP）产生的，它构成了不同个体的遗传基础，个体的多样性被认为是产生遗传疾病的原因。在整个基因组序列中，人与人之间的变异仅为万分之一，从而说明人类不同“种属”之间并没有本质上的区别。,SNP(single nucleotide polymorphisms,单核苷酸多态性) 1996年，Lander报道了SNP，制备第三代遗传连锁图的遗传标记。 基因组中单个核苷酸的突变称为点突变; 理论上每个单核苷酸位置最多只有4种形式,但某些群体特定的单核苷酸位置只有2个或3个SNP,这些位点称为双等位或三等位; 在基因组编码顺序中，SNP 大多位于密码子的摇摆位置，表现为基因沉默而被大量保留下来; 大多数SNP所在的位置不能被限制酶识别，必须采取测序或寡核苷酸杂交检测; SNP 在基因组中的数量极大，二倍体细胞中每个SNP最多只有2种等位型;,* SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换（transition)或颠换(transversion) 所引起，也可由碱基插入或缺失所致。但通常所说的SNP并不包括后两种情况。,基因组中的这类多态性有助于解释个体的表行差异、不同群体和个体对疾病，特别是对复杂疾病的易感性，以及对各种药物的耐受性和对环境因子的反应。大量存在的SNP位点，使人们有机会发现与各种疾病，包括肿瘤相关的基因组突变；从实验操作来看通过SNP发现疾病相关基因突变要比通过家系来得容易；有些SNP虽然不直接导致疾病基因的表达，但由于它与某些疾病基因相邻，而成为重要的标记。,SNP的意义和应用,一、 疾病连锁分析和未知致病基因的定位： 由于SNP数量大，分布广，在任何已知或未知致病基因附近都可能找到众多的SNP，用于遗传病的单倍型分析。 估计1000个SNP于400个微卫星位点扫描得出的连锁信息量等同。,SNP的意义和应用,二、 疾病的关联分析 群体中某种疾病与某个特定SNP位点等基因的频率是否相关。一个遗传标记的频率在患者明显高于正常个体时，表明该标记与疾病关联。通过比较分析两者的单倍型和发现连锁不平衡。1. 肝炎的慢性化2.白内障3.老年性痴呆4.妊娠高血压5.疾病相关基因鉴定，如牛皮癣、哮喘相关基因SNP的鉴定6.SNP检测与临床表现的相关性，如抗高血压药物疗效的个体差异7.单基因遗传病诊断，如血友病、地贫,SNP的意义和应用,三、 复杂疾病或过程的基因定位 进行简单和复杂疾病的遗传连锁分析及关联分析，用于疾病易感基因定位；而且其定位的精度较为微卫星技术精细得多。,SNP的意义和应用,四、 法医学应用五、疾病发生的分子遗传机制的阐明六、环境因子易感基因的检出 绝大多数SNP本身不是易感性的原因，但在全基因组范围内比较易感和非易感人群的SNP图谱，可显示易感人群基因组的结构特点，并通过关联分析或连锁不平衡分析指导寻找易感基因。七、药物基因组学研究（药物敏感性差异） 同一药物对不同个体产生的效果不完全相同这是由于药物本身在不同个体体内活化、代谢和清除等方面的差异决定的八、在器官移植中供体和受体之间的配对选择及物种进化的研究中都将具有重要意义。,在未来，一张个体的基因组的结构图谱（SNP图谱）和一张个体的基因组表达图谱将能全面地描绘出个体的遗传物质及其功能状态。,DNA指纹技术（DNA Profile） 基本原理：人类基因组超过90的序列为重复序列，它们不编码mRNA前体或其它RNA，由串联、重复排列而成的DNA序列构成数量可变的串联重复序列（Variable number of tandem repeats VNTR），其串联重复单位的数目在人群中存在较大差异性，具有高度多态性。重复单位长度为1070bp的称为小卫星DNA，重复单位为16bp的称为微卫星DNA（microsatelitte DNA），又称STR（short tandem repeats）。,DNA指纹图的遗传规律,遗传方式：子代图谱中所有的片段都可以在双亲的图谱中找到，片段的传递符合孟德尔遗传规律。 个体的组织同一性：即来源于身体不同部位与类型的组织，其DNA指纹图谱是一致的。 群体遗传学特征：无法判断各靶基因座位基因型，因此不能按照传统遗传学方法调查人群中等位基因数和分析等位基因的频率。,不同的个体有不同的DNA指纹图,利用DNA指纹图进行亲子鉴定,DNA指纹图技术存在的缺点,无法确定等位基因。 对任何一条带，无法确定是由纯合子或杂合子产生。 无法确定每条带所代表的基因座即染色体定位。 无法确定基因座之间的独立性。 对检材要求较高。,STR（short tandem repeat）,短串联重复序列，也叫微卫星DNA，是一类广泛存在于真核生物基因组中的DNA串联重复序列。其核心序列为2-6bp，重复次数通常在15-30次。 DNA片段长度为100-350bp。它们也是染色体上的来自父母的配对的等位基因。,由于每个人STR基因座的核心单位重复次数不同，造成它们的DNA片段长度不同，因此构成了人群中极为高度的STR基因座的DNA片段长度的多态性。 多数STR基因座具有多态性，其高度多态性主要源于核心序列重复次数的个体间差异，这种差异在基因传递的过程中一般遵循孟德尔共显性遗传规律。,优点：仅需少量模板DNA，灵敏度、扩增效率高。第二代法医DNA指纹技术的核心个体识别率及非父排除率高STR检测和以往的DNA水平的检测相比，由于它在人类基因组中分布极为广泛，且片段小，等位基因多，杂合度高。如两个无关个体在14个STR基因座基因型完全相同的可能性仅为110-14，理论上讲目前地球上60亿人口中没有任何两无关个体在这14个STR基因座基因型完全相同。,传统的亲子鉴定需要进行血型测试：小孩至少要6个月大，还要大量的血液样本，过程烦琐、取样痛苦且错误率高。DNA亲子鉴定测试与之有很大的不同。DNA鉴定可以在任何组织，例如口腔上皮细胞取样。甚至在小孩未出世前、没有母亲参与的情况下进行，并且是目前亲子测试中最准确的一种-准确率可达99.99999，因此具有精巧、简便、快速、经济、实用的特点。,获得检材中细胞,经物理化学作用释放DNA,经过一系列实验操作及仪器分析得到分型结果,应用PCR反应的对DNA进行几何级数放大,统计学计算得出结论,1 家庭纠纷，或未婚先孕，怀疑子女不是亲生；抚养费纠纷。 2 怀疑医院产房或育婴室调错新生婴儿。 3 失散多年的家庭成员认亲。 4 移民公证，需确定要求移民者与某人有无亲生关系。 5 涉及计划生育政策，怀疑将亲生子女作为收养儿或将超胎子女给他人抚养等。 6 遗产继承纠纷要确定亲生关系，或试管婴儿的生父认定。,意义,目前鉴定效力最高的是15个STR位点的联合检测分析，其亲子关系认定率可达99.9999%以上。生物实验室采取DNA基因鉴定技术，可以使肯定生物学父子关系的准确率达99.99%，而否定生物学父子关系的准确率几近100%。,当前DNA亲子鉴定利用人类基因组中的重复碱基序列(STR)和PCR技术进行个体识别。 STR作为第二代分子标记，势必会被90年代后期诞生的第三代分子标记技术：一种被称为单核苷的多态（SNP）的技术所取代。美国911恐怖袭击中经过烈火高温焚烧后的尸体辨认工作曾因STR局限性而一度进展缓慢。不过，最终辨认工作依然顺利完成，这全应归功于科学家们采用了SNP技 术的创意性决策。 与此同时，中国亲子鉴定信息网的科学家正在开发用于亲子鉴定的SNP检测技术，志在跨越把SNP技术和基因芯片结合的技术难点，完成亲子鉴定基因芯片的设计和制造，并将其率先运用到中国的亲子鉴定事业中去。,测序技术在临床上应用,肿瘤易感基因检测 与大肠癌相关K-ras易感基因检测,K-ras基因是什么？K-ras基因为一种原癌基因，它在肿瘤细胞生长以及血管生成等过程的信号传导通路中起着重要的调控作用，在参与表皮生长因子受体（EGFR）信号传导过程起着分子开关的作用。EGFR单克隆抗体可与内源性配体竞争性结合EGFR，阻断EGFR介导的细胞通路，产生抗肿瘤效应。而一旦K-ras基因发生突变，（EGFR）单克隆抗体就会失效，不能起到抑制肿瘤的作用。,正常的K-ras基因（野生型）可抑制肿瘤细胞生长，而一旦发生突变，它就会持续刺激细胞生长，打乱生长规律，从而导致肿瘤的发生。,肿瘤易感基因检测 与大肠癌相关K-ras易感基因检测,EGFR基因是什么？EGFR是一种细胞膜表面的糖蛋白受体，具有酪氨酸激酶活性，是原癌基因Cerb一1(HER一1)的表达产物，是表皮生长因子受体（HER）家族成员之一。研究表明在许多实体肿瘤中存在EGFR的高表达或异常表达，EGFR基因与肿瘤细胞的增殖、血管生成、肿瘤侵袭、转移及细胞凋亡的抑制有关 。,肿瘤易感基因检测 与肺癌相关EGFR基因检测,抗EGFR单抗作用机制抗EGFR单抗通过阻断EGFR二聚体的形成，抑制其下游的细胞内信号传导，从而抑制肿瘤细胞的存活、增殖、转移以及心血管生成KRAS基因突变致抗EGFR单抗失效Kras基因突变可旁路激活细胞内信号传导，从而导致抗EGFR单抗丧失抗癌活性,K-ras基因与结直肠癌我国大肠癌发病率已占到常见肿瘤的第四位，这其中很多都是30至40岁的中年人。K-ras基因突变在西方结直肠患者人群中，K-ras基因突变型约占40%，我国目前没有大样本测序数据，一项基于国内40家检测中心已完成的近1000例K-ras基因检测结果显示，65.9%的结直肠癌患者为K-ras野生型。大部分突变发生在密码子12和13，密码子61的突变发生率很低。,DNA测序中检测的K-ras突变点针对KRAS基因突变的检测主要集中密码子12和13,1 结直肠癌从此“一分为二”K-ras基因是野生型还是突变型，使传统意义上的一种疾病被分成两种独立的疾病。K-ras突变型结直肠癌患者约占40%，这类患者不能从抗EGFR治疗中获益，反而徒增不良反应危险和治疗费用。其余60%左右的K-ras野生型患者就很有可能从这类药物治疗中获益。,K-ras基因检测临床意义,2 对结直肠癌预后评价K-ras可以筛选出抗EGFR（表皮生长因子受体）靶向药物治疗有效的大肠癌患者，实现肿瘤病人的个体化治疗，从而达到良好的预后，延长患者生存期。早期检测K-ras还可以通过该基因的状态了解到病人的复发转移风险，为将来选择最佳治疗做好准备。,K-ras基因检测临床意义,3 提高了对结直肠癌的靶向治疗K-ras基因突变检测做为结直肠癌患者进入个体化靶向治疗疗程之前需要进行的检测，已被美国癌症综合网络（NCCN）列为结肠癌临床治疗指南与直肠癌临床治疗指南临床用药必检项目：用于辅助临床医生筛选出可受益于Cetuximab（西妥昔单抗/爱必妥）和Panitumumab（帕尼单抗）等特效药的结直肠癌患者。另外，09年NCCN非小细胞肺癌临床实践指南明确指出：当K-ras基因如果发生了突变，则不建议病人使用特罗凯（Tarceva/厄洛替尼/Erlotinib）进行分子靶向治疗。,K-ras基因检测临床意义,肺癌是当今世界各国常见的恶性肿瘤，并已成为绝大多数国家癌症死亡的主要原因。其中以非小细胞肺癌(NSCLC)最常见。目前靶向治疗已经成为非小细胞肺癌（NSCLC）临床治疗的重要手段。 易瑞沙（吉非替尼）和特罗凯（厄罗替尼）作为表皮生长因子受体（EGFR）酪氨酸激酶抑制剂(TKI)，是美国FDA批准用于NSCLC靶向治疗的主要药物。 但是，临床试验表明易瑞沙和特罗凯仅对10-30%的NSCLC病人有显著疗效。进一步的研究发现EGFR基因突变与NSCLC靶向治疗的疗效具有相关性，绝大多数携带EGFR基因突变的病人疗效显著。,EGFR基因检测临床意义,大量研究资料表明EGFR基因突变主要集中在酪氨酸激酶区(18-2l外显子)，其中19外显子多为框内缺失(746-753)性突变，约占所有突变的45；21外显子多为替代突变(主要是L858R)，约占所有突变的40。目前普遍认为，这两个热点突变可以增强肿瘤细胞对TKI的敏感性，并且可作为TKI治疗的有效预测指标。因此，检测EGFR基因突变对于指导NSCLC病人临床用药具有重要的参考价值。,EGFR基因检测临床意义,EGFR基因检测临床意义,EGFR基因检测临床意义,2007年及2008年多项期临床研究的回顾性分析显示，西妥昔单抗或帕尼单抗无论单药或联合化疗仅对KRAS野生型的mCRC患者有效。KRAS成为第一个结直肠癌靶向治疗的重要分子标志物。 帕尼单抗是第一个抗表皮生长因子受体(EGFR)的完全人源化单克隆抗体。,1 一次测序可以检测多个突变位点 由于病毒耐药的点突变位置存在多种可能。 传统的荧光定量方法只能一次检测