艾滋病梅毒和乙肝检测方法介绍及选择

艾滋病、梅毒、乙肝检测方法介绍及选择,湖北省疾病预防控制中心彭庭海2014年5月,艾滋病、梅毒、乙肝-概况,母婴传播,艾滋病：约1535% HIV阳性孕妇会发生母婴传播。90%以上儿童HIV感染者是由母亲垂直传播而感染 。梅毒：流产、早产、死胎或马鞍鼻、先天性耳聋等。乙肝：在我国，人群中40-50%是由母婴传播积累而成。,主 要 内 容,一.艾滋病实验室检测技术HIV抗体检测核酸检测CD4+T淋巴细胞检测二.梅毒检测技术显微镜检查法血清学检查法三.乙肝检测技术HBV免疫标志物检测HBV-DNA,一、艾滋病检测技术HIV抗体检测核酸检测CD4+T淋巴细胞检测,HIV抗体检测,筛查试验（包括初筛和复检）确证试验（WB）,HIV抗体筛查样品,血清/血浆/全血滤纸干血斑唾液尿液,筛查试剂,国家食品药品监督管理局注册批准有效期内酶联免疫试剂应批批检合格选择敏感性和特异性高的试剂,筛查方法,酶联免疫吸附试验（ELISA）化学发光或免疫荧光试验：采用发光或荧光底物，用发光或荧光仪测定结果。快速检测（RT）及其它检测试验 (1)明胶颗粒凝集试验(PA) (2)免疫渗滤试验 (3)免疫层析试验,(1)酶联免疫吸附试验（ELISA）,HIV抗体检测试剂：检测HIV-1/2抗体HIV抗原抗体联合检测试剂：可同时检测血液中HIV-1P24抗原和HIV-1/2抗体用酶标仪测定结果,四代艾滋病酶联免疫试剂比较,第四代,病毒裂解液重组抗原合成肽HIV-1 / -2 / -Oanti-p24 Ab,IgM / IgG 抗体HIV-1 / -2 / -Op24 抗原,病毒裂解液重组抗原合成肽HIV-1 / -2 / -Oanti-p24 抗体,ELISA酶联免疫吸附实验 ELISA Enzyme linked immuno sorbent assay,+ ve,- ve,阴性对照,阳性对照,阴性,阳性,质控,酶联免疫吸附试验（ELISA）,优点：准确性高、价格低廉、判断结果标准客观、结果便于记录和保存用途：流行病学监测及临床大量标本的检测,(2)化学发光或免疫荧光试验,采用发光或荧光底物既可检测抗体，也可联合检测抗原抗体酶或荧光标记的HIV抗原或抗体，加发光或荧光底物用发光仪或荧光仪测定结果,全血样品 加50ul样品于样品垫中,手指血方法,静脉血方法,加一滴缓冲液,15分钟内读取结果,（3）快速检测（RT）及其它检测试验,快速检测（RT）及其它检测试验,优点:试验简便快速，适用于应急检测、门诊急诊检测。不需专门设备和人员培训,一般可在1030分钟内得出结果。缺点:肉眼判断较主观、价格较贵、结果不易保存。,HIV抗体筛查检测流程图,HIV抗体确证试验,确证试验的试剂： 必须是经国家食品药品监督管理局注册批准、在有效期内的试剂。确证样品： 可采用血清、血浆、滤纸干血斑确证试验方法： 免疫印迹试验(WB)、条带免疫试验(LIATEK HIV)、放射免疫沉淀试验(RIPA)及免疫荧光试验(IFA)。国内常用的确证试验方法是WB。,HIV抗体确证实验结果,初筛检测阳性标本,两种筛查试剂,报告阴性,阴性反应,一阴一阳,阳性反应,确证试剂,复检试验,根据具体情况进一步检测HIV-2,报告阴性,出现HIV-2指示条带,阴性反应,不确定反应,报告HIV-1 阳性,HIV-1 阳性反应,结合流行病学资料，可以在4周后随访检测，如带型没有进展或呈阴性反应，则报告阴性；如随访期间出现阳性反应，则报告阳性；如随访期间带型有进展，但不满足阳性标准，应继续随访到8周。如带型没有进展或呈阴性反应则报告阴性；满足HIV抗体阳性诊断标准则报告阳性，不满足阳性判断标准可视情况决定是否继续随访。,HIV抗体确证检测流程图,产时艾滋病抗体检测及服务流程,实验室需备有：12种HIV-1/2抗体ELISA（化学发光）试剂2种HIV-1/2抗体快速试剂百度“HIV抗体试剂临床评估”,HIV抗体母亲 HIV 抗体经胎盘进入胎儿，出生时新生儿和婴儿早期抗体阳性，不一定是感染出生时母亲的抗体，8090% 在生后 912 个月消失，出生后 18 个月基本上全部消失18 个月后儿童 HIV抗体仍然阳性，视为自身感染产生的抗体,18个月以下婴幼儿的HIV诊断,婴幼儿HIV感染的抗体检测,适用于：HIV感染产妇所生婴幼儿；母亲HIV感染状态不详，儿童出现HIV相关临床表现，临床怀疑HIV感染的儿童。婴儿12个月时进行HIV抗体检测 阴性排除感染，纳入正常儿童保健； 阳性者继续追踪随访，至18个月再次进行HIV抗体检测，结果阴性排除感染。,艾滋病病毒感染产妇所生儿童,阳,阴,用另一种不同原理或不同厂家生产的筛查试剂再次检测,12个月进行HIV抗体筛查试验,确证试验,18个月时再进行HIV抗体筛查试验,报告HIV抗体检测结果阴性,艾滋病感染产妇所生儿童HIV抗体检测流程,阳性,阴性,阴性,阳性,用另一种不同原理或不同厂家生产的筛查试剂再次检测,阴性,阴性,阳性,报告HIV抗体检测结果阳性,提供咨询，继续随访，4周后再次进行确证试验,不确定,阳性,18个月以下婴幼儿的HIV诊断,核酸检测HIV 前病毒 DNA（HIV DNA）检测已整合到外周血液中血细胞基因组上的 HIV DNA基于 PCR 技术高特异度(98%)和高灵敏度 (99%),18个月以下婴幼儿的HIV诊断,HIV 病毒载量（HIV RNA）用来监测已知的HIV 感染病人的病毒载量试验；真阳性的结果通常 100,000 拷贝/毫升, 而假阳性结果350/mm3的艾滋病感染孕产妇，采用预防性抗病毒用药方案；对于CD4+T淋巴细胞计数350/mm3的艾滋病感染孕产妇，采用治疗性抗病毒用药方案。,常规CD4+T淋巴细胞检测的方法和程序,流式细胞仪检测方法 双平台方法 单平台方法样品：EDTA、枸橼酸（ACD）或肝素抗凝全血运送条件：室温（1825）保存和运输样品避免极端温度（结冰或大于37）高温季节，需用隔热容器盛装样品，并将其置于有冰袋和吸热物质的容器中。,常规CD4+T淋巴细胞检测的方法和程序,48小时内染色，染色后6小时内分析；如采血后24小时内染色，可在染色后24小时内分析；利用CD45单克隆抗体设淋巴细胞门，可检测放置72小时的样品；在血球分析仪生产商允许的样品采集时间范围内检测。,FACSCalibur流式细胞仪,二、梅毒检测技术显微镜检查法血清学检查法 梅毒特异性抗原血清学检测 梅毒非特异性抗原血清学检测,各期梅毒的取材部位和检查方法,临床表现 取材部位 检查方法一期梅毒 溃疡、淋巴结 暗视野检查 血液 血清学检查二期梅毒 皮损、淋巴结 暗视野检查 血液 血清学检查三期梅毒 血液、脑脊液 血清学检查隐性梅毒 血液 血清学检查胎传梅毒 皮损、胎盘 暗视野检查 血液 血清学检查,（一)、显微镜检查法,1.暗视野显微镜检查2.直接免疫荧光试验（DFA）3.渡银染色检查,1.暗视野显微镜检查,暗视野显微镜下，典型的梅毒螺旋体呈白色发光, 其螺旋较密而均匀。运动规律，运动性较强，其运动方式包括旋转式，围绕其长轴旋转；蛇行式, 全身弯曲如蛇行；伸缩其螺旋间距离而移动。观察其运动形式有助于与其他螺旋体相鉴别。未检出螺旋体不能排除梅毒的诊断，阴性结果可能说明：螺旋体数量不足(单次暗视野显微镜检查阳性率小于50%)。患者已接受抗生素或杀灭梅毒螺旋体的药物治疗。损害接近自然消退。损害不是梅毒。,2.直接免疫荧光试验（DFA),在荧光显微镜下可见到发苹果绿色的梅毒螺旋体。临床意义与暗视野显微镜检测相同。DFA的特异性及敏感性均大于暗视野显微镜检测。,3.梅毒螺旋体渡银染色检查,梅毒螺旋体具有亲银性，显微镜下可见到染成棕色的梅毒螺旋体。临床意义基本同暗视野显微镜检查法。,(二)、血清学检查法,血清学检查是辅助诊断梅毒的重要手段。当人体感染梅毒螺旋体后410周左右，血清中可产生一定数量的抗类脂质抗原的非特异性反应素（主要是IgM、IgG）和抗梅毒螺旋体抗原的特异性抗体（主要是IgM、IgG）。这些抗体均可用免疫学方法进行检测。,梅毒血清学检测方法,1.非梅毒螺旋体抗原血清试验,1.1 性病研究实验室试验（Venereal Disease Research Laboratory test，VDRL）1.2 快速血浆反应素环状卡片试验（Rapid plasma reagin circle card test，RPR）1.3 甲苯胺红试验（Toluidine red unheated serum test，TRUST） 方法简便、快速，敏感性和特异性较好。对一期梅毒的敏感性为7487，二期梅毒达100，三期梅毒3494。特异性9699。,非梅毒螺旋体抗原血清试验临床意义,适用于各期梅毒的诊断。早期梅毒经治疗后血清滴度可下降或转阴，故可用于疗效观察、判愈、判定复发或再感染。也适用于人群的筛查、产前检查及健康体检等。VDRL试验适用于神经梅毒的脑脊液检查, 特异性高，但敏感性低。可在某些传染病及胶原病时出现假阳性反应，因此对阳性反应应结合临床进行鉴别，或做梅毒螺旋体抗原血清试验以进一步证实之。,2.梅毒螺旋体抗原血清试验,采用梅毒螺旋体作抗原，为特异性抗原，检测血清中抗梅毒螺旋体IgG或IgM抗体。敏感性和特异性均较高。一期梅毒的敏感性为70100，二期梅毒达100，三期梅毒9598，特异性94100。,梅毒螺旋体明胶颗粒凝集试验（TPPA）,原理TPPA试验用梅毒螺旋体致敏明胶颗粒，此致敏颗粒与人血清中的抗梅毒螺旋体抗体结合，产生可见的凝集反应。明胶颗粒为玫瑰红色，便于肉眼观察结果。,梅毒螺旋体酶联免疫吸附试验（TP-ELISA）,原理用经纯化及超声裂解处理的梅毒螺旋体为抗原包被固相板条加入待检血清和辣根过氧化酶标记的抗人IgG抗体，利用酶免疫法检测患者血清中的抗梅毒螺旋体特异性抗体。采用特异的梅毒螺旋体重组蛋白作为抗原，使试验更加敏感、特异。,梅毒IgM抗体血清学试验,梅毒特异性IgM抗体是梅毒感染最早期产生的抗体。IgM分子量较大不能通过胎盘屏障。因此在新生儿血中检测到IgM抗体表明有先天感染。如在患者的脑脊液检测到IgM抗体表明有活动性神经梅毒。血液中或脑脊液中出现抗梅毒IgM抗体均表示需要治疗。,梅毒螺旋体抗原血清试验临床意义,梅毒螺旋体抗原血清试验多用作证实试验，特别是隐性梅毒及一些非螺旋体抗原血清试验阴性而又怀疑为梅毒的患者。但不能用于观察疗效、判断复发及再感染。梅毒螺旋体抗原血清试验偶可出现生物学假阳性反应。,梅毒血清学试验的合理应用,非梅毒螺旋体试验阳性可能表示：现症感染、接受或未接受过治疗的近期感染、生物学假阳性结果。在一般人群中的假阳性率是1-3%。大部分假阳性血清抗体滴度1:4，但低滴度不能排除梅毒，可出现在潜伏或晚期梅毒病人中。梅毒螺旋体试验阳性可表示：现症感染、接受或未接受过治疗的近期感染、既往感染。,梅毒血清学试验的结果解释,梅毒感染产妇所生儿童随访及先天梅毒感染状态监测图,承担母婴阻断梅毒检测工作的实验室需备有,非梅毒螺旋体抗原血清试剂（TRUST或RPR）梅毒螺旋体抗原血清试剂（TPPA或TP-ELISA、TP-RT）有条件可备TP-IgM,诊断、监测方法,HBV血清学试验EIA检测HBsAg、Immunoblot assay,HBV-