两虫检测方法说明

隐孢子虫和贾第鞭毛虫检测的方法说明一、 标准接种 吸取2ml吐温-20稀释液（0.001%）加入标样管中，涡旋混匀后倒入乘有约1-2L纯水的广口瓶中，（标样共接种于10L水中，剩余水应在抽滤过程中分3次倒入）向标样管中加入3ml纯水，涡旋洗涤（并将标样管倒置，使管帽也被充分洗涤），将洗涤后标样管中的液体，倒入广口瓶中，重复5次。将广口瓶放置在磁力搅拌器上，并向其中投入磁力搅拌子。链接蠕动泵及过滤装置，开始过滤，流速控制在1-2L/min。（清洗容器应使用纯水，不要使用清洁剂）二、 样品的淘洗和浓缩1. 准备缓冲液在开始混合缓冲液前，首先确定有多少样品进行淘洗，根据样品量配制缓冲液。需要准备400ml纯水用于淘洗设备的预冲洗，每个样品至少需要400ml缓冲液。PS:配置1升淘洗液：在容器中加入8g NaCl,0.2g KCl,2.9g Na2HPO4以及0.2g KH2PO4溶在0.9L的试剂级纯水中。调PH值到7.4。加0.1ml吐温-20溶液到容器中再搅拌10分钟。（注意：吐温-20溶液非常粘，应该用吸液管小心移出）2. 转移到缓冲液瓶中缓冲液瓶包括一个10L瓶子和一个4L的瓶子，建议10L瓶子放淘洗液，4L瓶子用来盛放纯水。3. 初始化的系统检测在样品淘洗前用纯水代替缓冲液进行操作，用于检测设备系统可否正常使用，并可对系统内部的管路进行冲洗。a. 将一个未使用过的滤芯放入滤器中（这个滤芯如果只作为初始化系统检测及清洗管路时使用，可重复使用一个月）b. 完成样品淘洗过程的1-8步。c. 在淘洗结束后将离心管里的液体倒掉。d. 把滤器从淘洗设备中取下，然后把出口分流调节装置从滤器上取下。e. 用70%的酒精擦洗QC干体。f. 进行正式的样品淘洗。4. 淘洗样品a. 打开两虫淘洗设备的开关（开：电源开关空气压力阀，关：空气压力阀电源开关）打开空气压力泵。绿色的灯（显示电源）和红色的灯（显示设备处于准备状态）会亮。b. 把500ml锥形离心管的盖子打开，并把它放到淘洗设备里的离心管支架上。c. 把分流调节装置连接到滤器上的QF干体装置上。d. 滤器的上端向下，把分流调节器放在离心管上，这时会有水从分流调节器中流到离心管中。e. 把滤器上的QC主体连接到两虫淘洗装置上的QC肢体上。f. 确保缓冲液已经放在缓冲瓶中了。确保有插管的瓶盖盖到缓冲瓶上，且密封环完好，并把瓶盖拧紧。g. 按控制面板上的F1键开始两虫淘洗过程。h. 淘洗过程结束后，把滤器从淘洗设备上取下，然后把出口分流调节器从滤器上取下。i. 把滤芯从滤器中取出，并丢弃（通常经过高压处理后再弃掉）。j. 盖上离心管并从淘洗设备中取出。k. 用酒精清洗QC干体装置。l. 进行下一个样品淘洗。m. 用纯水代替缓冲液清洗残留在设备内部管路中的缓冲液。如果超过一周不使用淘洗设备需将设备中的水排干，将瓶中的水倒掉，空抽一次。5. 离心浓缩及转移浓缩液a. 离心机应放在牢固的工作台或地板上，尽量减少晃动。b. 平衡对称的离心管，和适配器、离心桶一起平衡，重量差别不超过0.5g，尽量减少摆动。注意：如果离心管不被平衡则会产生额外的震动，影响到目标物的沉淀。c. 设置离心机参数2000g，15min。样品在离心机中自然惯性停止，不可使用刹车系统急停。d. 用真空泵或蠕动泵吸取离心管中的上清液，在进口处装一个移液枪头（如5ml枪头）以减少进口的真空力度。最终留取5-8ml（可预先在管上做好标记）。流速控制在20020ml/min。注意把移液管放到液面中心，接近液面处上吸取上清液，以减少沉淀的损失。e. 将离心管中的剩余的浓缩液在涡旋混合器上混匀20秒。f. 用缓冲液润洗移液枪将所有液体转移至L型试管中。 （注意：移液枪头需要用缓冲液润洗下，是为了避免移液管壁因干燥而将两虫挂壁。）g. 使用纯水清洗两次移液管（如剩余体积为7ml,则每次1.5ml）,并将清洗液移入同一个L型试管中，每次冲洗后都要我选20秒再移出液体。三、 两虫的捕获 隐孢子虫/贾第鞭毛虫磁珠分选试剂盒：10XSLTM-BufferA，10XSLTM-BufferB,Dynabeads anti-Cryptosporidium隐孢子虫磁珠，Dynabeads anti贾第鞭毛虫磁珠。a. 配制1XSLTM-BufferA溶液：向900ul蒸馏水加入100ul 10XSLTM-BufferA。b. 向L型试管内加入1ml的10XSLTM-BufferA（10XSLTM-BufferA在0-4储存时可能会有结晶析出，使用前将其放置在室温下充分溶解）。c. 向L型试管内加入1ml的10XSLTM-BufferB。d. 将隐孢子虫磁珠用涡旋振荡混合器混匀后量取100ul加入到L型试管内。e. 将贾第鞭毛虫磁珠用涡旋振荡混合器混匀后量取100ul加入到L型试管内。f. 盖上L型试管盖，将其放置在DYNAL MIX混合器上，室温下混匀孵育1小时（这期间主要是磁珠对虫卵的捕获）。g. 孵育结束后，将L型试管移至DYNAL MPC-1磁极上，试管的平坦面朝向磁极。h. 将磁极持续呈90度角转动2分钟。i. 打开试管盖将上清液缓缓倾倒出去（注意此时磁极和L型试管不可分离）。j. 将L型试管从磁极上取下，加入1ml的1XSLTM-BufferA与试管内磁珠混匀（注意：此时不要使用涡旋混合器，为了进行充分的清洗，可以将这1ml试剂分成2-5次加入）。k. 将所有的液体和磁珠转移至1.5ml微型离心管（即EP管）内。l. 将EP管放置在DYNAL MPC-S磁极上。m. 将磁极持续呈180度角转动1分钟。n. 打开盖子，将上清液缓慢吸出，包括盖子上的液体也一并析出（此时磁板和磁极不可分离）。o. 将磁板从DYNAL MPC磁极上取下，并向EP管内添加50ul0.1N HCl，使用涡旋混合器混匀10秒钟。p. 将EP管在室温下放置10分钟，再涡旋混合10秒钟，将EP管插回到插有磁板的MPC-S磁极上，静置10秒钟，吸取上清液。q. 准备一个载玻片，向槽内添加5ul 1N NaOH。将上述EP管内的溶液全部转移至凹槽内。（此时不要从磁极上取下，转移过程中不要碰贴壁的磁珠）。r. 可以在室内自然干燥，准备进行染色。s. 如有需要可另取载玻片重复进行ps步骤1-2次，以提高回收率。四、 隐孢子虫和贾第鞭毛虫荧光染色 染色荧光试剂盒：Easy stain单克隆荧光抗体染色剂 ，fixing Buffer洗脱染色液，DAPI核染色剂，mounting mediun封固剂，阳性对照物，单孔载玻片。a. 当样品干燥完毕，下一步使用一滴甲醇进行固定（约50ul），静置若干分钟至完全干燥。b. 向载玻片上加一滴Easy stain将这滴液体用玻璃棒引它覆盖于整个井形凹槽，但是千万不要碰到载玻片上的两虫。c. 把载玻片放入一个潮湿的容器内，室温至少放置40分钟（可以适当延长，过夜也可）。如果放入37培养箱则需要放置30分钟。d. 吸掉其表面的多余液体，加入50ul的fixing Buffer静置2分钟。吸掉多余的液体。e. 加入50ul的DAPI染色稀释液（注意需要稀释5000倍，即2ul10ml，现用现配），并放置1分钟。吸掉多余水分，加1滴fixing Buffer,1分钟后再吸掉多余的水分。（注意不要使涂片干燥）f. 加一滴mounting mediun，加上盖玻片，并用棉纸吸掉多余的液体。在盖玻片周围涂上