束永前NGS肺癌临床应用束永前ws

,1,NGS在肺癌精准医疗中的应用,江苏省人民医院-束永前,高通量测序技术的发展及研究报道,高通量测序技术在肿瘤临床的应用,1,目录Table of Contents,3,DNA测序技术的演化和爆发性增长DNA Sequencing Technology has Grown Rapidly and Exponentially,4,一代,二代,三代,Sequencing Gets Cheaper and Faster,单人全基因组测序成本（美金）：HGP:$3 Billion2004:$30,000,0002008:$100,0002010:$10,0002011:$4,000 2014:$1,000?: $100,测序成本迅速下降，超过了摩尔定律Cost is Decreasing Exponentially, Beating Moores Law,5,6,2013年NEJM发表的临床文献，43%运用高通量技术,目前高通量测序大量应用于国内外临床癌症研究,21世纪的癌症分型需要病理和分子联合进行 ASCO 2014, Chicago, Dr. M Stratton (英国首相医学顾问）,7,在不同病理类型中，肺癌驱动基因突变谱存在明显的差异,NSCLC腺癌基因突变谱：亚洲研究,与欧美人群不同，EGFR依然是亚裔腺癌最常见的驱动基因,Koh Y, et al. 2013 ASCO Abstract 7572. Wu YL, et al. 2011.,早期肺腺癌中EGFR突变率和晚期相似,Zhang X, et al. 2013 ASCO Abstract 1547. Yang PC, et al. 2012 ASCO Abstract 1534.,8023：NTRK1基因融合作为肺癌新的癌基因靶点,结论在肺腺癌中通过NGS/FISH发现了一种新的癌基因NTRK1融合需要开展更多研究以明确NTRK1融合在肺癌中的发生率和特征该研究提示需要在NTRK1融合阳性患者中开展前瞻性Trk抑制剂的临床研究,Doebele RC, et al. 2013 ASCO Abstract 8023.,3/91 (3.3%),肺鳞癌驱动基因突变研究,71肺鳞癌病人标本NGS和定量PCR检测突变和基因扩增,Koh Y, et al. 2013 ASCO Abstract 7572. Govindan R, et al. 2012 ASCO Abstract 7006.,2013 ASCO,178例肺鳞癌标本127例（75%）患者确认潜在治疗靶点 检测基因拷贝数，外显子突变，mRNA表达和启动子甲基化,2012 ASCO,40.9% 的鳞癌患者存在联合基因突变，表明了鳞癌患者基因型的复杂性,12,NSCLC中FGFR1基因拷贝数增加,475例已行手术切除的I-III期NSCLC,多因素分析，在校正吸烟、性别和肿瘤大小后，伴FGFR1基因扩增的I/II期肺鳞癌患者的OS显著长于FGFR1未扩增的患者（HR=0.26; 95% CI: 0.08-0.84, P=0.02）18%的脑转移出现FGFR1拷贝数增加，而相应原发部位无增加,Tang XM, et al, et al. 2013 ASCO Abstract 7552.,FISH & IHC检测,FGFR1基因扩增,13,手术切除的肺鳞癌患者中FGFR1扩增对预后的影响,63例经组织病理学证实、临床已切除肺鳞癌评估FGFR1状态与临床特征#和DFS*之间的关系FGFR1扩增定义为FGFR1拷贝数2.2x CEP8拷贝数结果：FGFR1扩增与年龄(p0.99)、性别(p0.99)、吸烟史 (p=0.32) 或疾病分期 (p=0.18)之间无相关性多因素分析发现，FGFR1扩增与DFS改善显著相关 (HR 3.2, 95% CI 1.1-9.4),Hellmann MD, et al, et al. 2013 ASCO Abstract 7559.,*Log-rank，#Fishers 精确检验,PI3K通路驱动IV期肺鳞癌患者的转移模式和生存,68例 IV期 肺鳞癌患者的FFPE肿瘤标本FGFR1 扩增 (FISH)PIK3CA 突变 (Sequenom)PTEN 缺失 (IHC)PTEN 突变(外显子测序)采用Kaplan-Meier法估算生存率采用Log-rank检验和Cox比例风险法 进行组间比较,Paik PK, et al. 2013 ASCO Abstract 8022.,PI3K通路驱动IV期肺鳞癌患者的转移模式和生存,OS单因素分析：OS多因素分析：考虑到年龄、性别、KPS因素后，仍然显示PI3K与生存期短相关HR = 3.3，(95%CI:1.5-7, p=0.03) 转移部位的驱动基因分析脑转移在鳞癌中不常见，但在 PI3K异常肿瘤高达22%脑转移仅出现在PI3K异常肿瘤,Paik PK, et al. 2013 ASCO Abstract 8022.,结论：IV期PI3K异常肺鳞癌患者的生存较差脑转移在PI3K异常的患者中更常见，且仅出现在PI3K异常的患者中PI3K通路活化具有不同的生物学特点，以该通路为靶点的治疗方法可能是伴脑转移的肺鳞癌患者的一种有效治疗策略,小结,在不同病理类型中，肺癌驱动基因突变谱存在明显的差异即使同样的病理类型中，东方人群与西方国家人群(高加索人种)并不完全相同常见的突变基因方面，EGFR突变在亚裔(包括中国)人群中的发生率明显高于白种人群(30% vs. 17%), 而K-RAS突变则在白种人群的发生率远高于亚裔人群鳞癌患者的基因型较腺癌或更加复杂，其对生存的预后预测作用更加明显,靶向治疗耐药后基因突变研究,针对驱动基因突变研制的分子靶向药物在晚期NSCLC 治疗方面已经显现出巨大的优势。表皮生长因子受体(EGFR)敏感突变的患者，可从EGFR 酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)治疗中获得更好的疗效，但几乎所有患者迟早均要发生EGFR-TKI获得性耐药，中位无进展时间只有812个月当靶向治疗后出现耐药时，临床上面临众多治疗困惑，也是当今肺癌个体化治疗的研究热点之一,靶向治疗耐药机制,（1）EGFR二次突变，例如20外显子T790M、T854A、L747S、D761Y等。（2）下游信号传导通路基因突变，例如RAS、RAF、PI3CA、PTEN等。（3）旁路激活，例如HER2扩增或突变、MET基因扩增、ALK基因融合 ROS1基因融合、 AXL基因扩增等。（4）表皮间质化（EMT）。（5）转化为SCLC。,EGFR-TKI耐药机制：EGFR二次突变&其他致癌基因激活,Sequist LV, et al. Sci Transl Med 2011; 3(75); Adapted from Sequist LV, et al. 2012 ASCO.,cMET/ErbB3激活和过表达在EGFR-TKI 耐药过程中的作用,研究目的：1) 根据RTKs和通路蛋白的表达/激活比较ORR2) 评价EGFR-TKI治疗期间RTK和通路蛋白的调节3) 在接受EGFR-TKI治疗的患者中，评估EGFR基因突变的激活和RTK激活的相关性,RTK=络氨酸激酶,Ahn MJ, et al. 2013 ASCO Abstract 11113.,EGFR-TKI治疗NSCLC耐药过程中cMET/ErbB3激活和过表达的作用,无论EGFR突变状态如何，EGFR/cMET相对水平高的患者PFS显著更好随着cMET参与的程度越高或E/M指数越低，NSCLC的临床获益越差PFS越短(8个月)的患者,结论：cMET和ErbB3在NSCLC患者对EGFR-TKI产生耐药过程中具有重要作用E/M指数及其活化可作为选择EGFR抑制剂和cMET抑制剂的预测标志物，但还需要前瞻性临床研究的验证,Ahn MJ, et al. 2013 ASCO Abstract 11113.,NGS发现NSCLC靶向治疗新的合并突变,在人类H3255NSCLC细胞株 (携带EGFR L858R，但无BRAF V600E，对厄洛替尼敏感)中， BRAF V600E的过表达会导致耐药性的产生BRAF V600E介导的厄洛替尼耐药可通过BRAF抑制剂Vemurafenib逆转,结论：EGFR突变NSCLC可包含额外BRAF致癌驱动突变且在治疗前发生率低EGFR TKI治疗可以导致BRAF V600E表达肿瘤细胞扩增，产生获得性EGFR TKI耐药，而BRAF抑制剂治疗后可逆转,10倍,Blakely CB, et al. 2013 ASCO Abstract 11004.,收集EGFR-TKI治疗前及EGFR-TKI耐药后的FFPE标本，使用Illumina HiSeq2000进行398个肿瘤相关基因的外显子测序,伴T790M突变的EGFR突变型NSCLC患者中 ROR1 mRNA表达（来自EURTAC研究）,入组EURTAC研究中的95例患者：65%伴有治疗前T790M突变，评估45例患者的ROR1表达与治疗和生存的关系,结论：高ROR1表达显著限制伴T790M突变患者的PFSROR1导向治疗可提高厄洛替尼治疗伴ROR1过表达的EGFR突变型NSCLC患者的疗效,*仅在低ROR1表达者中有效,Karachaliou N, et al. 2013 ASCO Abstract 11027.,24,EGFR-TKI 获得性耐药的综合基因组分析,从11例EGFR突变NSCLC患者中获取厄洛替尼敏感性和耐药性肿瘤的FFPE活检标本从所有肿瘤和相应正常组织标本中提取DNA，进行全外显子组测序从所有肿瘤标本中提取RNA，进行全转录组测序,Weissman JS, et al. 2013 ASCO Abstract 11010.,第三代EGFR-TKI已经初步确立了临床疗效,Janne PA, et al. 2014 ASCO Abstract 8009.,通过NGS发现C797S突变为AZD9291的获得性耐药突变,Thress et al, Nat Med. 2015, doi:10.1038/dm.3854,通过全外显子和转录组测序对厄洛替尼获得性耐药的EGFR突变NSCLC的肿瘤标本进行完整基因组分析,本研究：证实了完整基因组分子测序在接受靶向治疗的NSCLC患者的临床管理中具可行性和实用性发现了NSCLC患者中厄洛替尼获得性耐药的已知和新的分子生物标志物揭示了在NSCLC患者中调控干细胞和神经元表型以及免疫逃逸的遗传事件在厄洛替尼获得性耐药中具重要作用，而这一作用以往却被忽略了使我们深入了解了NSCLC中逃逸EGFR癌基因抑制的分子发病机制,Weissman JS, et al. 2013 ASCO Abstract 11010.,耐药驱动基因研究小结,耐药后驱动基因图谱发生了变化，且这种变化在靶向治疗的同时不断演变更多的实验认为这种变化是靶向治疗后基因筛选的结果耐药后再次活检是明确新的致癌驱动基因的有效方法更多针对获得性耐药的药物正在研发中,NGS的临床应用探索仍在继续 -2015 ASCO最新报道,29,世和基因版权所有,EGFR 信号通路（红色为世和检测的重要节点基因）,EGFR 为肺癌最主要用药基因常见突变集中于18，19，20，21外显子；但突变类型多变，包括点突变，缺失，插入，拷贝数变化。这些对用药都有极其重要意义传统热点检测只能检测一种突变类型如点突变，往往漏掉许多重要信息基因上下游综合信号通路分析也至关重要，如RAS-RAF-MEK-ERK及PI3K-AKT等,NGS与肺癌,EGFR专题,30,31,EGFR少见突变研究进展Unusual mutation of EGFR,EGFR基因常见激活突变21外显子L858R、19外显子非移码插入突变目前检测较多18-21外显子其他敏感突变如G719Xaa、L861Q、S768I目前检测较少,最新大样本研究结果显示，在3项肺癌临床实验600例肺癌患者中，12%（75/600）肺癌患者携带18-21外显子少见突变（如G719Xaa、L861Q、S768I），并根据突变情况分成三组，给予阿法替尼给药治疗。,第一组：18-21外显子少见点突变,第二组：单独T790M突变或者T790M突变与其它突变共存,第三组： EGFR基因20外显子插入突变,James C-H Yang et al. Lancet oncology 2015,发现耐药机制 Reveal Drug Resistance,发现耐药机制实现个体化治疗，真正做到“对症下药耐药机制也是临床科研领域的热门领域，高分值科研成果,32,2015年ASCO会议报道EGFR-TKIs新耐药机制,33,2015年ASCO会议报道了肺癌两种驱动突变，同时也是EGFR-TKIs耐药机制：MET基因14外显子缺失和NF1基因失活突变,P. Paik et al. 2015 ASCO Abstract 8021；PA. Redig et al. 2015 ASCO Abstract 80222.,总结,随着研究的深入，我们不断发现新的肺癌驱动基因，不断完善肺癌的驱动基因谱，并研发新的靶向治疗药物EGFR基因是突变概率最大、最多病人治疗获益的靶点，尤其是在亚裔患者，除了常见位点，携带少见EGFR突变，通过NGS检测出来仍然能通过靶向药物获益由于原发或继发性耐药的发生，未来驱动基因的检测决不是一次性就可解决的问题，需要伴随治疗过程进行动态的检测测序技术的不断发展优化是未来根据驱动基因选择靶点治疗的技术保证，是个体化治疗的基础,高通量测序技术的发展及研究报道,高通量测序技术在肿瘤临床的应用,2,目录Table of Contents,35,精准医学时代的到来,肺癌精准医学是精确诊断与靶向治疗的结合,精确诊断 靶向治疗,未来5年内靶向临床药物的选择将会有一个爆炸性的增长Explosive Growth for Targets Therapies Expected in Next 5 Years,FDA 统计于2012年,38,肺癌临床药物及治疗Targeted Therapies in Lung Cancer,39,肺癌靶向药物极多且选择逻辑复杂，目前在国内上市的肺癌药物有以下六种此外肺癌还有20款以上药物在国外上市或处于临床实验中，包括AZD9291、CO-1686等,肺癌临床药物及治疗Targeted Therapies in Lung Cancer,肺癌靶向药物还有20款以上药物在国外上市或处于临床实验阶段，包括AZD9291、CO-1686等,40,目前靶向治疗现状 （I/IV）,41,现国内常见检测位点，一般为几个基因，几个位点,目前靶向治疗现状 （II/IV）,42,信号通路复杂性决定了：一代桑格测序采用的一个或几个基因检测不能准确的指导用药,目前靶向治疗现状 （III/IV）,43,美国麻省综合医院现采用的癌症检测包括236个基因的全长测序德州MD Anderson Cancer Center 正在研发的检测包括近400基因,如果要准确进行个性化用药，我们需要了解癌症突变全景,相关基因：包括信号通路上下游基因、同一基因家族基因等,目前靶向治疗现状 （IV/IV）,44,基因的突变类型多种多样，单位点检测漏掉大量信息,高通量测序可以一次检测上面列举的所有突变类型,人类基因组结构变化示图：基因突变类型多种多样,通过临床新一代测序技术(NGS)揭示基因变异高检出率以指导肺癌的靶向治疗,386个肺癌FFPE标本，95%为NSCLC (367/386)通过NGS为基础的诊断性检验方法来描绘基因变异图谱检测182个癌症相关基因的3320个外显子检测肿瘤中重排频率较高的14个基因的37个内含子结果：确认1205个基因改变，平均每个肿瘤3.31个改变 (0-10)85%(310) 标本包含1个可作为靶点的基因改变* ，平均每个标本1.79个 (0-6)在68% (248)的肿瘤中，至少1个检测到的基因变异会被目前“热点”检测* *所遗漏,Ali SM, et al. 2013 ASCO Abstract 8020.,*可作为靶点的基因改变定义为具有相应的靶向抗肿瘤药物或能够在临床研究中加以评价的基因靶点改变* * 热点检测包括EGFR, KRAS 和EML4: ALK 等,通过临床新一代测序(NGS)揭示基因变异高发生率以指导肺癌的靶向治疗：结果,结论：该研究发现了通过热点检测所无法检测到的一系列基因变异，可显著提高驱动基因