病毒和病毒成份的提纯

0 第十四章第十四章 病毒和病毒成份的提纯病毒和病毒成份的提纯 一 病毒的提纯 一 沉淀法 二 层析法 三 两相溶剂间分配系数法 四 红细胞吸附法 五 电泳法 六 超速离心法 七 超滤法 二 病毒蛋白亚单位的分离 三 病毒脂质的抽提 四 病毒糖类的抽提 一 病毒的提纯 所谓病毒提纯 就是应用各种物理 化学方法 以不使病毒受损伤和失活为前提 去除宿主细胞组分等非病毒杂质 提取出高纯度浓缩的病毒样品 病毒提纯是病毒学研 究的重要前提 病毒微细形态结构的研究 病毒抗原蛋白的分离提纯 病毒化学成分及 其遗传物质 DNA 或 RNA 的详细研究都需要高纯度的病毒样品 病毒纯度只是一个相对的概念 很难有绝对的标准 通常以下几点可以作为判定 标准 1 物理均一性 测定病毒样品的物理均一性 是证明其纯度的常用方法 包括电镜检查 病毒粒子 沉降系数和扩散常数及其在凝胶电泳 等电聚焦中的迁移率等 2 病毒滴度与蛋白含量的比例 测定病毒材料的感染力或其血清学反应滴度与其蛋白含量的比例 也是一种通常 采用的纯度测定方法 病毒滴度对蛋白含量的比例越高 说明病毒的纯度越高 1 3 免疫学反应 免疫反应单一而无非特异反应 则说明病毒材料比较纯净 4 结晶形成 病毒粒子在十分纯净的情况下 经常可以形成结晶 但少数混有杂质的病毒样品 亦可形成结晶 所以这也只是一个相对标准 病毒提纯的主要依据和条件有病毒提纯的主要依据和条件有 1 病毒只在活的细胞内寄生 复制和增殖 要在病毒不失活的前提下 使之从细 胞中释放出来 去除细胞成份 有些病毒如痘病毒 正粘病毒 副粘病毒 披膜病毒 病 毒粒子被释放到细胞外 可以从培养液或尿囊液中提纯 而另一些病毒如腺病毒 乳多 空病毒 小 DNA 病毒 在毒粒成熟后只有少数病毒释放到细胞外 大量提纯时必须首先 裂解细胞 使病毒大量释放 实验室常用冻融 研磨 高速捣碎 超声波处理或高压冲 击 中性去污剂裂解 蛋白酶解等物理和化学的方法 通过这些方法处理获得的粗制 的病毒悬液 其中常含有大量的细胞碎片 一个有效的方法是以 2000 6000r min 离心 30 40 分钟 可除去 90 以上的细胞碎片和杂质 2 病毒粒子实际上是大的蛋白颗粒 可以应用提纯蛋白质的一些技术方法 3 对大小 形状和密度高度一致的病毒粒子 可以采用分级分离的技术 当然不 同的病毒 其生长特性及理化学性质不同 因此提纯方法也不尽一致 一 沉淀法 主要是从稀的悬浮液中浓缩病毒 有中性盐沉淀法 聚乙二醇 PEG 沉淀法 有机 溶剂沉淀法 等电点沉淀法 皂土法和鱼精蛋白沉淀法等 1 中性盐沉淀法 病毒一般在 45 以上饱和度的硫酸铵溶液中沉淀 且保持其感染性 在含有病毒 的组织培养液中加入等体积的饱和硫酸铵 可以很容易地沉淀某些病毒如狂犬病毒 鸡 新城疫病毒等 2 聚乙二醇沉淀法 聚乙二醇 PEG 为水溶性非离子型聚合物 具有各种不同的分子量 用于病毒沉 的主要是分子量为 2000 6000 的 PEG 将 PEG 配成 50 左右的溶液 或直接将固体 PEG 2 加于毒悬液中 使其达到所需浓度 通常在 4 搅拌过夜 然后离心使病毒沉淀 Tanncock 1985 年 成功地用 PEG 浓缩了禽脑脊髓炎病毒 3 有机溶剂沉淀法 甲醇 氯仿 正丁醇 氟碳化合物等都可用于提纯病毒 但乙醚 氯仿等脂溶剂 对于具有脂质囊膜的病毒具有破坏和灭活作用 故不适于这类病毒的浓缩提纯 4 等电点沉淀法 病毒粒子在等电点时 所携带的正电荷与负电荷相互中和 因而失去相互排斥的 作用而发生沉淀 多数病毒的等电点在 pH4 5 5 5 之间 因此在 pH3 6 范围内均可沉 淀 由于一部分细胞成份在等电点时亦发生沉淀 此法效果不太理想 但从感染的组织 培养液中浓缩病毒 可以获得较好结果 应用酸性范围的等电点沉淀或分级沉淀病毒时 必须注意 pH 对病毒活性的影响及病毒粒子电荷与组织蛋白电荷的差异 5 皂土法 Girin 1989 年 应用皂土在酸性条件下 pH4 4 5 吸附轮状病毒 SA 11 再在碱 性条件下 pH 8 5 又使其洗脱下来 从而达到纯化目的 6 鱼精蛋白沉淀法 鱼精蛋白为碱性蛋白 具有携带其它蛋白质共沉淀的作用 能和直径大于 50nm 的 病毒共同沉淀而不影响病毒的感染力 当向这种沉淀物加入 1mol L NaCl 时 病毒又重新 释放到悬液中 而鱼精蛋白仍然沉淀 直径小于 50nm 的小型病毒则不与鱼精蛋白共同沉 淀 因此 可利用鱼精蛋白去除病毒材料中直径大于 50nm 的异种蛋白质 二 层析法 病毒粒子表面携带特定的电荷群 因此病毒对离子交换树脂及类似的其它吸附剂 具有亲和性 利用吸附剂的层析法分为两种 一种是正吸附法 即依据病毒粒子表面所 携带的电荷进行特异性吸附 然后用适当浓度的离子溶液将病毒粒子解离回收 另一种 是负吸附法 即只吸附组织或宿主细胞成份等非病毒蛋白 而让病毒粒子通过 收集滤 液后经差速离心沉淀法回收病毒 由于各种病毒的大小和表面结构等理化性质不同 因 此对吸附剂的亲和性也有显著的差异 3 1 萄聚糖柱层析法 将初步浓缩的材料 通过葡聚糖 G 150 或 G 200 柱层析 然后用 0 02 0 15mol L 磷酸盐缓冲液 pH7 6 洗脱 分部收集 测定 280nm 波长处的 OD 值 将含病毒的各部分 相混合 再浓缩 透析之后 即可得到比较纯净的病毒 Nagano 1989 年 用 Sephacryls 1000 柱层析纯化了鸡传染性支气管炎病毒 2 凝胶层析法 磷酸钙凝胶 这是病毒吸附层析法中较为常用的凝胶 由 0 5mol L CaCl2和 0 5mol L Na2HPO4 溶液混合制备凝胶状沉淀物 在中性条件下生成的凝胶称为 brushite 在碱性条件下生成的凝胶称为羟基磷灰石 hydroxypatite 两者均用 0 001mol L 磷酸盐缓冲液悬浮 置于 4 4 5 天 使它充分沉淀后应用 氢氧化锌凝胶 是由 7mol L 氨水与 0 1mol L 醋酸锌溶液滴加混合 pH8 5 而制 备的 在制备后数小时内较稳定 可作为吸附剂 Newton 和 Beris 等将水泡性口炎病毒 悬液与氢氧化锌凝胶混合 使其形成复合体后沉淀 然后用 0 08mol L EDTA pH8 5 解 离病毒 获得较好的回收量 焦磷酸镁凝胶 是由 0 1mol L 焦磷酸钠和 0 1mol L mol MgCl2 以 2 10 体积 比例在室温中缓慢滴加混合而获得的较稳定的焦磷酸镁凝胶 西村等将牛痘病毒悬液同 此凝胶混合 使病毒吸附于凝胶 然后用 0 1mol L 盐水洗 2 次 最后用 0 3mol L 枸橼 酸钠溶液解离病毒 将病毒较好地回收于水相中 3 离子交换纤维素柱层析法 离子交换层析适于分离几乎所有带电荷的分子 通常有阴离子交换剂和阳离子交 换剂两种 某些病毒可以被离子交换剂经离子键作用而吸附 通过改变平衡液的离子强度 使其再洗脱下来而达到纯化目的 腺病毒和口蹄疫病毒被 DEAE 纤维素吸附 可分别再 用 0 5mol L 和 0 15mol L NaCl 溶液洗脱下来 从而得以纯化 4 亲和层析法 亲和层析是一种特殊的吸附层析 基质与待分离物具有特异的生物亲和力 通常 是将特异的抗体经共价偶联作用结合在配基上组成一种不溶性配基 当相应的抗原物质 通过固定配基装成的层析柱时 即被吸附 随后再改变实验条件 将其洗脱下来 达到 纯化的目的 该法是于 80 年代初期开始用于病毒的分离提纯 不仅纯度好 敏感 而且 回收率高 4 Njayou 1991 年 应用此法成功地提纯了麻疹病毒 他们应用猴抗麻疹病毒的 IgG 进行共价偶联 获得了高纯度而有活性的病毒 回收率可达总回收成份的 30 Rimmelzwaan 1987 年 应用犬细小病毒的中和性单克隆抗体亲和层析 纯化了细小病毒 经 SDS PAGE 和 ELISA 鉴定 99 以上的杂蛋白被洗除 收获了 70 90 的病毒抗原成 份 三 两相溶剂间分配系数法 该法主要原理就是高分子物质以溶质形式存在于两相溶剂中 根据其分配系数的 不同而选择性地分配于其中的一方 从而达到纯化的目的 所采用的溶剂主要有 葡聚 糖硫酸盐 Dextran Sulphate DS 和聚乙二醇 PEG 或甲基纤维素 MC 和聚乙烯醇 PVA 形成 Ds PEG 系 Ds PVA 系和 Ds MC 系 利用病毒在有机溶剂中的分配原理 在适当 的溶剂系统和葡聚糖层之间进行多次反复转换 不仅能够浓缩病毒 而且还可以纯化病 毒 通常是将两相溶剂如 Ds PEG 以适当的重量百分比混合 然后加入病毒液 数次 激烈振荡混合 置于 4 24 36 小时 即可分离为两层 病毒将特异地分布于其中一方 如 Ds 层中 适当改变溶剂的混合比例时 分配于 Ds 层中的病毒可由 Ds 层转入 PEG 中 而得以浓缩 若调节适当 一步就可浓缩 100 倍 两步浓缩就可以达到 10000 倍 非病毒物质通常以不同的方式进行分配 从而达到浓缩纯化的目的 Nammar 1991 年 应用 Ds PVA 系纯化了反转录病毒 两相溶剂间分配系数法简单 温和 并能使病 毒得到较高的浓缩和纯化 但是为了获得高度纯化的病毒 还需配合应用其它方法 四 红细胞吸附法 所谓病毒的红细胞凝集反应 就是指病毒被红细胞表面粘蛋白吸附的现象 自 Hirst 发现流感病毒的红细胞凝集性质以来 随后相继发现其它一些动物病毒也有红细 胞凝集性 Stanley 证明 流感病毒在 0 时被红细胞吸附 而在 37 时却从红细胞上 脱离下来的性质 从而将此方法应用于病毒提纯 我们实验室应用醛化鸡红细胞吸附马流感病毒 取得较好效果 具体方法是 采取鸡血 以无菌生理盐水洗涤 3 次后制成压积红细胞 另取福尔马林和生理盐 水等量混合 制成福尔马林盐水 在 2 份福尔马林盐水中加入 1 份压积红细胞 充分振 荡 15min 置 2 8 冰箱内 48h 每天振荡 2 3 次 届时取出 再振荡 1 次 后用 700r min 离心 5 10min 弃上清 再加 20 倍量生理盐水 振荡混合后置 2 8 冰 箱过夜 弃上清 加入 20 倍量生理盐水 如上洗涤 3 次 取沉淀红细胞 加入相当于 初次压积红细胞量的生理盐水 混匀后即可应用 将马流感病毒感染的鸡胚尿囊液 作 2500r min 离心 10min 吸取上清液 取保 存于 2 8 的病毒液 100ml 加入 2 8 的醛化红细胞悬液 6ml 充分振荡 15min 立 5 即放入冰箱内每 2h 振荡 1 次 共 2 3 次 随后置冰箱中过夜 待其自然沉淀 次日吸 出上清 如其血凝价在 1 15 以下 则证明已经充分吸附 此时即可进行释放 否则需再 补加醛化红细胞悬液继续吸附 在已充分吸附病毒的醛化红细胞沉淀中 加入相当于原 病毒液 1 10 量的 5mol L NaCl 溶液 充分振荡 置 37 水浴中 4h 每隔 30 60min 振 荡 1 次 取出后立即以 700r min 离心 10min 吸取上清液 即为浓缩病毒液 必要时 可对已释放过病毒的醛化红细胞作第二次释放 方法同前 上述吸附 释放方法 可将病毒浓度提高 10 倍左右 以血凝效价表示 五 电泳法 先将病毒悬液对缓冲液透析 根据病毒的种类不同 选择适当的缓冲液 但离子 强度不能超过 0 3mol L 以上 病毒粒子依据其所携带的电荷 在电场中或向正极 或向 负极移动 因此电泳结束后 分段收集病毒区带部分 就能达到提纯的目的 六 超速离心法 病毒粒子经过初步浓缩之后 要进一步纯化 通常采用超速离心法 它是分离提 纯不同大小的病毒的有效方法之一 在应用超速离心法沉淀病毒时 必须了解所用离心 机的离心力 离心机由于转头的回转产生了强大的离心力 这种离心力是随转头的大小 和离心管至转轴中心的距离而变化的 高速和超速离心机的离心条件 有的以每分钟速 度 r min 表示 有的则以离心力 重力加速度 g 980cm S2 为单位来表示 离心沉 淀时 沉降速度与离心力有关 离心机转速在 4000r min 左右的称为低速 普通 离心机 转速至 25000r min 左右 的称为高速离心机 转速 25000r min 以上的称为超速离心机 高速和超速离心机装有冷 冻装置和抽真空装置 以保持离心腔中恒定的低温 并减少转头运转时空气的摩擦力 超速离心机有制备和分析用两类 最近又生产出制备 分析及区带连续离心三用装置在 一起的离心机 有的还带扫描装置 使用超速离心机的分离提纯方法有三种 1 差速离心法 2 速度区带离心法 3 平 衡密度梯度离心法 或等密度梯度离心法 1 差速离心法 这是应用较早的简单方法 建立在不同大小和比重的粒子在沉降速度上存在差别 的基础上 具体做法是将被分离的样品交替进行低速离心与高速 或超速 离心 沉降速 度差别在一个或几个数量级的粒子 可用本法分离提取 粒子大小 转速与离心沉淀时 间的关系 差速离心适用于从组织培养液 鸡胚尿囊液或经过红细胞吸附 释放的病毒 悬液中提纯病毒 在由感染细胞或组织匀浆中提取病毒时 由于与病毒大小相近的细胞 6 亚单位及碎片的存在 提纯效果不理想 差速离心法的优点是能迅速处理大量样品 故 常作为病毒精制的第一个阶段 或者用于病毒样品的浓缩和粗提 以差速离心法分离提纯病毒时 经常以低速 2000 3000r min 20 30min 及中 速 10000r min 20 30min 去除较大的宿主细胞碎片 污染的细菌及其他较大的杂质 然后 选择在 60min 内能够沉淀 80 以上的病毒粒子的较高速度 离心 1 2h 使病毒 沉淀 对中 大型病毒如流行性感冒病毒 在经红细胞吸附 释放后 于 25000r min 离 心 60min 即可达到目的 小型病毒如脊髓灰质炎病毒 披膜病毒 则需以 35000 45000r min 离心 1 2h 高速或超速离心沉淀物 可用研磨和超声波振荡等方法打碎后 悬浮于缓冲液中 对于非病毒杂质较多的样品进行差速离心 由于病毒对沉淀物的非特 异性吸附而有较多损失 2 速度区带离心法 是根据被分离物质在强大离心力中沉降速度不同而进行的分离方法 该法使用的 介质密度应该小于被分离物质的密度 介质可以为均一密度 也可以为梯度密度 当被 分离的物质沉降到与介质密度相等的区域时就不再沉降 不同分子形成不同的区带 而 称为速度区带 该法要求样品浓度为顶端浓度梯度的 1 10 样品体积为离心管体积的 5 常用的介质有蔗糖 甘油 聚蔗糖等 在病毒纯化时 将病毒样品溶液层加于密度 梯度层的顶部 借助病毒粒子或其亚单位成分本身的浮密度差别 在离心力作用下降到 密度相等的介质层内 最后排列成带状停留不动 密度较小的粒子或成分停留在上面的 几层内 密度较大的粒子或成分沉降于下面几层内 应用密度梯度法 可以获得相当纯 净的病毒样品 病毒粒子或成分的沉降速度取决于其大小 形状及比重 也取决于离心 力及悬液介质的密度和粘度 蔗糖是生物大分子粒子密度梯度分离时最常应用的材料 因其易溶于水 且对核酸及蛋白质呈化学惰性 常用的梯度范围从 5 20 或 10 60 除蔗糖浓度连续梯度离心外 近来有人在两层浓度梯度上层加病毒浓缩样品 经 超速离心后将病毒收集于两层界面处 也有人在单层蔗糖浓度溶液上层加病毒浓缩样品 经超速离心 使病毒沉淀于蔗糖溶液底部 这两种方法比较简单 但浓缩提纯的效果远 远不如多层连续梯度法 3 平衡密度梯度离心法 平衡密度梯度离心法是根据粒子的浮密度不同而加以分离 所谓浮密度就是物质 的质量减去在一定介质中所受的浮力 亦称有效密度 制备梯度的方法有两种 一种是在饱和的 CsCl 溶液上面层加病毒样品 容量比 1 4 另一种是将病毒样品与 CsCl 浓溶液均匀地混合 一般用水平转头 经较长时间的超 速离心 在离心管中形成 CsCl 的浓度梯度 并由于离心力的作用 样品中的病毒粒子分 布于相应密度的区域内 这种方法在分析离心中是最常用的 应用本法时 离心转头的 7 回转数越高 离心时间越长 越能接近平衡状态 平衡密度梯度离心法广泛应用于病毒和核酸的提纯上 用平衡密度梯度离心法提 纯的动物病毒有多型瘤病毒 牛痘病毒 乙型脑炎病毒 狂犬病病毒和马传贫病毒等 有的病毒在这些无机盐类溶液中被破坏 可加入 0 2 0 5 牛血清白蛋白 或用 0 5 3 0 甲醛先将病毒粒子固定 然后进行平衡密度梯度离心 常能较好地回收病毒 大多数病毒的浮密度在 1 10 1 40 范围内 所以制备密度范围为 1 0 1 7 的悬浮介质 便可满足大多数病毒密度梯度离心的需要 4 密度梯度离心法的操作程序 1 密度梯度的制备 制备密度梯度的方法有不连续的 即人工操作 和连续的 即 机械操作 密度梯度两种 不连续的或分层的密度梯度的制备不连续的或分层的密度梯度的制备 不连续的密度梯度是以人工操作法制备的 在 一定温度下 一般在 20 或在 25 配制一系列浓度差为 5 的梯度溶液 例如蔗糖可配制 成 5 10 15 20 25 30 35 40 W V 等溶液 用蒸馏水或适宜的缓冲液配制 用 皮下注射器或微量吸管 小心地先吸取浓度最大的溶液注入离心管底 然后依次加入较 低的各个浓度 40 5 一层覆盖着一层地层加于离心管中 注意避免产生气泡 假如 各层界面被冲动破坏 则应重新制备 也可以将长针头插入管底 依次从浓度低到高加 入各溶液 连续的密度梯度的制备连续的密度梯度的制备 为了产生一个连续的密度梯度 常用梯度混合装置来制备 梯度 梯度混合装置由 A 和 B 管组成 两管之间用双通活塞联结 在活塞关闭的状态下 向 A 管中加入低浓度蔗糖溶液 向 B 管中加入高浓度的蔗糖溶液 两管中容量要相等 在 B 管出口处用一根聚乙烯小管连接到离心管 在给 B 管充液时 可将聚乙烯小管的流 出口向上转动 使之超过液体的水平面 从而阻止液体流出 充液后可将小管接到离心 管中使之贴着管壁 然后开动小搅拌器 使搅拌棒转动 同时打开两管间活塞 这三个 操作要同时进行 以保证梯度的连续性 当梯度液体自 B 管流出时不允许移动离心管 待离心管中所盛的梯度溶液的体积达到需要量之后 将离心管小心地静止于 4 1 2h 以平衡之 现在不少 制备用超速离心机 携带有 密度梯度制备自动装置 按照这个方法 制备的蔗糖浓度梯度 理论上按公式计算 这些浓度梯度是根据样品和实验目的而专门选用的 一般使用的浓度梯度范围为 20 5 40 10 或 60 10 等 2 加入样品 用如上所述注射器或微量吸管吸取悬浮于适宜缓冲液中的病毒或核 酸样品 约梯度介质体积的 1 10 容量 从液面上方 1mm 处 紧贴着离心管壁轻轻层加 于梯度介质面上 3 高速或超速离心 将加入样品的离心管装入套管内 也可将离心管置于转头的 8 套管内 以免在装进套管时震动液体 拧紧套管螺帽 将套管吊在水平转头上 置于离 心机内 梯度离心一般用高速或超速离心机 离心速度和时间 根据所分离的样品选定 离心开始 样品中各种粒子逐渐分离 分布于相应的密度梯度层中成为带状 如为透明 的聚碳酸酯离心管 则可以清楚地见到带状分离 并拍照 离心时间到时 使离心机自 然停止 不许制动 以免破坏梯度 4 梯度的分段收集 取样 在离心完了以后 为了把已分离物质的各条带分开 必须取出梯度溶液 梯度溶液的分段收集方法有如下几种 取代法 从离心管底部穿刺或将带长针头的注射器插入离心管底 使一种稠密 的介质 如 60 70 W V 蔗糖溶液 缓慢地注入于离心管底部 然后用一个注射器或移 液管 从上面逐一移出各部分 或者在离心管的颈部加上一个塞子 这个塞子附着一根 收集导管 通向一个部分收集器 收取各部分 穿刺法 将离心管固定于特制的固定架上 在其底部装上一个垂直向上的空心 针穿刺 使梯度溶液自由滴出 可用部分收集器或用小试管分段收集 超速离心机一般 都带有此装置 此装置的缺点是离心管在用一次后即废弃 虹吸法 此法的优点是不必穿刺离心管 离心管可反复使用 经我们多次试验 此法简便易行 对梯度密度无破坏 用一根大穿刺针截两段做虹吸管 以接上 50 100ml 玻璃注射器进行送气的方法 分段收集梯度溶液 注射器吸取法 用弯曲的针头 J 状 接在注射器上 从梯度最上层开始向下逐 层小心吸取液体 5 梯度各层液体的密度测定 1 称重量法 用 10ul 微量注射器吸取样品 加入于已知重量的毛细管中 在 1 10 万分析天秤上称重 计算重量 g ml 即为梯度溶液的密度 2 测定折射率法 用阿贝氏折光仪测定各梯度层溶液的折射率 25 3 浮漂法 向已制备好的各种密度溶液中滴入一滴样品 找出相应的样品浮密 度溶液 即为该梯度层的密度 6 各梯度分层液中病毒分布的鉴定 1 以紫外分光光度计测定蛋白质和核酸吸收峰 吸取各层梯度溶液 用蒸馏水 或缓冲液适当稀释后 测定波长 280 和 260nm 的 OD 值 然后以各梯度层管号为横坐标 其 OD 值为纵坐标画曲线 即为各梯度层中蛋白质 病毒含量图 有些病毒 260nm OD 值较 高 2 以各种血清学方法测定各梯度层中病毒的抗原效价或用组织培养法测定病毒滴 度 证实病毒分布区域 3 用电子显微镜负染法观察病毒粒子及其纯度 将各梯度层样品装入透析袋中 9 置于适宜的溶液中透析去盐 然后取一滴样品用蒸馏水稀释 滴附于铜网膜上 用磷钨 酸负染后电镜下观察病毒粒子 七 超滤法 超滤法是利用超滤膜将水 盐及小分子滤过 将一定大小的大分子或病毒等颗粒 截住从而使后者得到浓缩的一种方法 超滤膜的孔径有多种 可根据被截留的分子大小 而选择 超滤法是浓缩大容量的病毒样品的一种非常有效的方法 其优点是可以在室温 或低温下操作 对被浓缩的产物损害很小 浓缩的同时可达到部分纯化 如选择合适的 膜和操作参数 可达到很高的回收率 此外 超滤系统可密封以防止外来污染 超滤系 统目前主要有三种 即搅拌池式 浅道流动系统和中空纤维系统 搅拌池式是一种最简 单的超滤系统 由超滤室及磁力搅拌器组成 通过正压而使液体通过滤膜 此方法简单 但浓缩样品量有限 一般在 2000ml 以内 而且滤膜孔易于堵塞 浅道流动系统的特点是 液体在膜表面的螺旋形浅道中流动 液体与膜的接触面积也大于搅拌池系统 因而滤过 速度大为提高 中空纤维系统是由很多根空心纤维成束装配而成 每根纤维即为一个微 细管型膜 因此 其有效的膜面积远远大于前二个系统 滤过速度很快 适用于大体积 的浓缩 二 病毒蛋白亚单位的分离 病毒具有几种以上的蛋白质 每一种蛋白质通常都由分子量较小的许多相同的亚单 位组成 病毒的结构蛋白决定着病毒粒子的结构及其与细胞受体部位结合的特异性 病 毒的血清学特异性和酶活性也决定于蛋白质 结构蛋白还有保护病毒核酸的作用 核 酸处于蛋白外壳的内部 或与蛋白质互相缠绕而成核蛋白 因此病毒基因组受到有关蛋 白质的保护 从而可以抵抗理化学因素的降解作用 蛋白质构成病毒质量的大部分 病毒粒子内的蛋白质可以单独地或与糖 脂类结 合在一起 成为糖蛋白或脂蛋白 病毒结构蛋白可以从提纯的病毒制品中通过与核酸和 其它蛋白分离 而又不打断肽键的处理方法得到 分离时须用中性去污剂 极性试剂或 阻止蛋白聚合的保护剂如尿素 盐酸胍 去氧胆酸钠和 SDS 等 或改变 pH 值等方法加以 处理 三 病毒脂质的抽提 病毒中有许多种脂类化合物 包括磷脂 中性脂肪 脂肪酸 脂肪醛及胆固醇等 病毒脂质的主要成分是磷脂 它在许多病毒中具有结构上的功能 病毒的磷脂就在囊膜 中 它对病毒颗粒的结构完整性是很重要的 这是因为当这类病毒用脂溶剂或某些磷脂 酶处理后就显著地丧失了感染性 10 病毒脂质大部分来源于感染前就存在于宿主细胞的脂质 病毒的有些脂质与糖结 合形成糖脂 有些脂质与蛋白结合形成脂蛋白 抽提病毒脂类时最常用的溶剂系统是氯仿 甲醇 有人应用此溶剂系统抽提 SV5 的病毒脂质 其方法是 1 取冻干的病毒样品 用氯仿 甲醇 水 65 25 5 的溶剂 在室温下抽提二次 每次 20 min 接着在氮气下用沸腾的溶剂抽提一次 20min 2 合并抽提物 加入其 1 6 体积的水 混合后分为水相和有机相 如存在神经节 甙脂 则进入到水相中 而其它全部脂质仍留在有机相中 3 将这一部分溶剂移到旋转器或蒸发器中 在氮气下驱除有机溶剂 即获得总的脂 质 四 病毒糖类的提取 糖是所有病毒核酸的组成成份之一 有些病毒还含有葡萄糖基嘧啶