Krupple样因子6及诱导型一氧化氮合酶在铜绿假单胞菌上清液感染RAW2647凋亡.doc

Krupple样因子6及诱导型一氧化氮合酶在铜绿假单胞菌上清液感染RAW2647凋亡 网络出版时间网络出版地址样因子及诱导型一氧化氮合酶在铜绿假单胞菌上清液感染凋亡过程中的表达刘梦茹，王雅琪，张伟，姚富荣，苍林，柴文戍（锦州医科大学附属第一医院呼吸内科，辽宁锦州；青岛大学附属医院检验科，山东青岛；锦州医科大学，辽宁锦州），修回日期基金项目辽宁省自然科学基金资助项目（）；辽宁省大学生创新项目（）作者简介刘梦茹（），女，硕士生，研究方向肺部感染性疾病，；柴文戍（），女，博士，教授，硕士生导师，研究方向间质性肺病与肺部感染性疾病，通讯作者，文献标志码（）中国图书分类号；摘要目的检测样因子（，）及诱导型一氧化氮合酶（，）在铜绿假单胞菌（，）上清液感染的小鼠单核巨噬细胞白血病细胞（）中的表达水平，探讨及在上清液感染凋亡过程中的作用。 方法法检测上清液对增殖的影响；流式细胞术检测凋亡率；染色检测细胞核形态变化；检测上清液对、表达的影响。 结果上清液抑制的增殖，且其抑制作用呈浓度和时间依赖性，上清液能够明显增加的凋亡比例，促进、的表达。 结论能够抑制的增殖，其可能通过增加及的表达，从而诱导细胞凋亡。 关键词铜绿假单胞菌；凋亡；炎症铜绿假单胞菌（，）是院内感染最常见的一种革兰阴性机会致病菌，易感人群主要为肺囊性纤维化、慢性阻塞性肺疾病、肿瘤、获得性免疫缺陷症等免疫力低下的患者。 近年来，已经成为医院感染高患病率和致死率最常见的致病因子之一，且耐药率呈逐年上升的趋势。 本实验选取作为研究对象，意图探明其对免疫细胞的作用机制，从而为治疗其感染寻找新的靶点。 于单核细胞的巨噬细胞是被招募到炎症部位的主要先天免疫细胞。 在机体发生感染导致局部炎症产生后，这些被招募到炎症部位的巨噬细胞在炎症的发生、扩散和消退过程中起着关键作用，巨噬细胞增殖能力降低，减弱了巨噬细胞吞噬病原体的能力，造成持续感染，损伤肺组织。 巨噬细胞的增殖与凋亡在感染过程中发挥着重要的作用，因此，探讨上清液对巨噬细胞增殖抑制、凋亡的影响是控制感染机体的关键。 样因子（，）是样锌指转录因子家族的成员，参与多种细胞增殖、凋亡等过程。 在炎症反应的基因表达调控中发挥重要作用，有报道表明，与诱导型一氧化氮合酶（，）之间是有作用联系的。 通常不在细胞中表达，在巨噬细胞中，通常是由一些病原体或者细胞因子刺激，诱导合成并产生一氧化氮（），破坏细胞稳定，发挥细胞毒性作用，促进细胞凋亡，也可导致周围组织损伤。 我们前期研究发现，可诱导肺组织细胞中的表达，并可能通过调控，介导肺组织细胞凋亡。 本实验以小鼠单核巨噬细胞白血病细胞为研究对象，探讨上清液对凋亡的影响，同时检测及在此过程中的表达情况。 材料细胞株与菌株细胞，北部战区总医院心血管病研究所赠予。 为标准菌株，锦州医科大学微生物实验室。 试剂培养基（）；胎牛血清（）；试剂盒（上海翊圣生物科技有限公司）；、蛋白浓度测定试剂盒、凝胶配制试剂盒（北京索莱宝科技有限中国药理学通报；（）公司）；染色液（万类生物科技有限公司）。 仪器流式细胞仪、成像仪（美国公司）；半干转仪（美国公司）；高速冷冻离心机（德国公司）。 方法细胞培养与传代细胞在含胎牛血清的中，、条件下进行培养，每半量更换培养基。 细胞生长至融合时，按传代培养。 菌株、细菌培养及细菌上清液的制备将细菌株复苏后，取血琼脂平板上单个菌落，接种于的大豆肉汤培养基中，通过振颤法（，）对进行增菌，获取的浓度的菌液，然后离心，获得上清液，用孔径的滤膜过滤，最后灭活（、），储存在备用。 检测细胞增殖将细胞按照个孔接种到孔板中，培养过夜。 后，分为阴性对照组（只加细胞）、上清感染组（体积比为、的上清液与培养基的混合液），每组个复孔，置于、细胞培养箱培养，分别培养、后，每孔加入染色液，在细胞培养箱内继续孵育。 吸弃上清，每孔加入，酶标仪在测定每孔的吸光度值，实验重复次。 细胞增殖抑制率（实验组值阴性对照组值）。 染色细胞以个孔接种于孔板中，置、细胞培养箱培养后，分别加入体积比为、的上清液与培养基的混合液，以为检测点，吸尽培养液，加入固定液固定，洗，加入染液，室温孵育，洗涤遍，每次。 随后在细胞成像多功能检测仪微米级分辨率，观察凋亡细胞核形态。 双染流式细胞仪检测细胞凋亡取对数生长期细胞，按个孔接种于孔板，置、培养过夜，按浓度梯度加入上清液，对照组为正常培养的细胞，为检测点。 离心收集细胞，用预冷洗涤次，加入重悬细胞，每管加入混匀后，避光室温反应。 检测前，加入，内检测完毕。 检测及的表达细胞培养、分组和干预同“”，另设体积比为的上清液与培养基混合液，分别作用、，收集细胞，加入裂解液，冰上充分裂解，提取总蛋白。 按蛋白浓度测定试剂盒说明进行蛋白浓度测定，分离蛋白，用电转仪半干法转至硝酸纤维素膜上。 加入稀释的一抗，稀释的一抗，稀释的一抗，孵育过夜，洗涤次，每次，再加入稀释的二抗孵育。 最后滴入超敏显影并曝光。 以目的蛋白与内参蛋白的条带灰度值之比表示各蛋白的相对表达水平，实验重复次。 统计学分析用统计软件分析数据，计量资料以珋表示，多组均数比较采用单因素方差分析，多组样本两两比较采用法，方差不齐时采用非参数检验。 结果上清液对细胞增殖的抑制作用的结果显示，在、时，与对照组相比，上清液组细胞增殖抑制率均明显增加（）。 不同浓度上清液组之间比较，细胞增殖抑制率随着浓度的增加而增加（）。 不同浓度上清液组组与组比较，细胞增殖抑制率随着时间的延长而增加（）。 说明上清（珋，）；中国药理学通报；（）液能明显抑制细胞的增殖，抑制效应呈浓度时间依赖关系。 作用细胞后的形态学变化经染色后，对照组细胞的细胞核呈蓝色圆形或椭圆形，染色体均匀一致；经不同体积浓度比的上清液处理细胞后，细胞核固缩，深染，核内可见浓染致密的块状颗粒，这些细胞核形态变化均为细胞凋亡的表现，其中以的上清液处理组最为明显，见。 ；诱导细胞凋亡的流式细胞仪检测结果显示，细胞与不同浓度的上清液作用后，与对照组相比，细胞的凋亡率随着上清液浓度的增高而增加（），浓度上清液组与浓度上清液组比较，细胞凋亡率有明显增加（）。 与、浓度上清液组比较，浓度上清液组细胞凋亡率均有明显增加（）。 提示上清液增加细胞凋亡比例呈浓度依赖性。 上清液促进细胞及的表达如所示，与对照组相比，上清液组能够以浓度依赖性的方式增加蛋白表达（），同时表达增加（）；与浓度上清液组比较，浓度上清液组表达增加（），表达增加（）；与、浓度上清液组比较，浓（珋，）；度上清液组表达增加（），表达增加（）；尤以浓度上清液组变化明显。 如所示，浓度上清液组分别作用、后，与对照组相比，组、组、表达水平均明显增加（，），组与组比较，及表达增加，差异有统计学意义（，）；以实验组变化更为明显。 讨论是引起院内感染致死率较高的最主要病原体之一，的毒力因子能够抵消宿主防御，并且能对宿主组织造成直接损害或提高细菌的竞争力，诱导多种免疫细胞凋亡，导致机体发生急、慢性感染。 中国药理学通报；（）（珋，），；，；，（珋，），；，加之近年来，由于对越来越多的抗生素产生耐药性，因此，研究对免疫细胞的作用机制对感染的治疗有重要作用。 本研究结果显示，上清液能够明显抑制细胞的增殖，说明的致病机制可能是通过抑制机体的免疫细胞，从而抑制了机体的免疫反应，导致机体或局部的炎症反应持续存在，迁延不愈。 迄今为止，关于诱导细胞凋亡的分子机制有了广泛的研究。 种主流的细胞凋亡诱导途径相关的凋亡相关基因主要包括配体（）、和。 其中，是一种能够与死亡受体结合，并介导细胞毒性诱导的细胞凋亡的配体。 能够抑制细胞凋亡，然而，也通过线粒体途径诱导细胞凋亡。 抑制活性，并拮抗其抗细胞凋亡作用。 但目前关于和在对巨噬细胞凋亡方面的研究甚少。 近年来，对于在炎症调节方面的作用研究较多。 例如能够直接与启动子形成复合物，调控表达释放，破坏细胞的稳定性，发挥细胞毒作用，参与病毒感染诱导的炎症反应，下调上皮细胞中基因的表达后，表达减少，活性降低，减轻了气道高反应，并延缓了炎症的发展。 早在年，等就已经证实，巨噬细胞可通过表达的增加，激活的释放。 等及王春波等的研究表明，可转录生成，促进细胞凋亡。 由此推测，本实验结果中，和的表达水平同时增加是由于诱导增加了的表达，而表达的上调是由诱导的，同时，能够促进释放，从而参与细胞凋亡。 这一途径形成了单核巨噬细胞生长抑制和细胞毒性作用的基础，促进巨噬细胞凋亡。 综上所述，上清液抑制了细胞增殖，诱导细胞凋亡，可能是由于刺激表达的增加，从而调控的表达，激活的释放，促进细胞凋亡。 和可能共同参与了上清液诱导的细胞凋亡。 然而，的表达是否依赖于的诱发，在上清液诱导细胞凋亡过程中是否起决定性作用，还有待于进一步研究。 本研究为减轻感染引起的炎症反应提供了新的理论依据和研究方向。 （致谢本实验在辽宁省锦州医科大学附属第一医院转化医学研究院完成，感谢各位老师和同学对实验的指导与帮助！）参考文献，中国药理学通报；（），（），（），（），（），（），（）喻