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发酵策划范文 工业微生物菌种的分离与选育试验蔡鹏龚有丽秦建汉黄敏实验目的筛选出纤维素酶产生菌株实验原理纤维素酶是将纤维素水解成纤维二糖和葡萄糖的一种复杂酶系，又称纤维素酶系。 纤维素酶的种类繁多，也很广。 大多数纤维素酶主要微生物体。 目前，人们对各种微生物(包括真菌和细菌)的纤维素酶的关注较多，尤其是源于真菌的纤维素酶。 所有能分解微晶纤维素的真菌，均能或多或少地分泌纤维素酶，所以纤维素酶的真菌源非常广泛。 而真菌中的霉菌由于纤维素酶产量高、活性高，因此成为目前纤维素酶的主要生产菌种。 发展具有自主知识产权的产纤维素酶霉菌菌种是近年来的研究热点。 1材料与方法1.1样品、培养基、试剂样品1.树林里的腐烂树叶、2.土豆培养基PDA培养基、羧甲基纤维素培养基。 如配固体培养基则另外添加总重15%的琼脂粉。 试剂:刚果红染色试剂(刚果红染色液、NaCl脱色剂)、DNS法测羧甲基纤维素钠发酵液酶活力所用试剂、苏丹混和染液。 实验步骤1.配制PDA培养基1.1配制步骤其做法是先洗净去皮,再称取300g马铃薯切成小块，加水煮烂（煮沸2030分钟，能被玻璃棒戳破即可），用四层纱布过滤，再据实际实验需要加葡萄糖和琼脂，继续加热搅拌混匀，稍冷却后再补足水分至1000毫升，分装试管或者锥形瓶，加塞、包扎，（121）灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面或者摇匀，冷却后贮存备用。 1.2配制PDA培养基注意事项 (1)培养基经灭菌后，必须放在37C温箱培养24h，无菌生长者方可使用。 (2)PDA培养基一般不需要调pH。 对于要调节pH的培养基，一般用pH试纸测定其pH。 如果培养基偏酸或偏碱时，可用lmol/LNaOH或lmol/LHCL溶液进行调节。 调节时应逐滴加入NaOH或HCl溶液，防止局部过酸或过碱破坏培养基成分。 (3)培养基在使用时也可以做成不含琼脂的液体培养基，用于菌类的震荡培养。 2.配制羧甲基纤维素培养基2.1分离培养基羧甲基纤维素培养基配制方法羧甲基纤维素钠5g，KH2PO4lg，琼脂17g，NaN033g，KCl05g，MgSO405g，蒸馏水1000ml，FeSO4001g，(调节pH在5.56.0。 于121，01lMpa下灭菌30min备用)。 3.样品采集、产纤维素酶真菌的富集与分离 (1)在湿润且含有大量腐烂植物的环境采集样品， (2)接种到羧甲基纤维素钠的液体培养基中， (3)28摇床培养。 (4)将培养液系列稀释后涂布PDA固体培养基平板上，28培养23d，分离得到霉菌菌株。 4.可降解纤维素真菌的初筛方法(刚果红染色)向长有霉菌的羧甲基纤维素钠固体培养基平板上加入浓度为05%的刚果红溶液3mL，染色30min，然后依次用蒸馏水和1mol/L的NaCl溶液彻底洗去染液，再用5%(m/v)的醋酸固定颜色。 若菌产生纤维素酶，则在菌落的周围会出现清晰的透明圈。 以透明圈直径与菌落直径之比的大小为参考指标对菌株进行初筛:比值大的证明该菌株的纤维素酶产量高;反之，则证明该菌株的纤维素酶产量低，可以将其剔除掉。 4.1可降解纤维素真菌的复筛将参照菌株及初筛获得的纤维素钠水解圈/菌落直径比值较大的菌株接种到PDA培养基上，28培养45d进行活化，之后接种到30mL(250mL三角瓶)PDA液体培养基中，于28、180r/min下摇床发酵，3d后取样测定上清发酵液中的CMC酶活力。 5.DNS法测CMC酶活本实验将酶活力定义为:在适当的温度和pH值条件下，每1min水解相应的底物转化成1mg还原糖的酶量定义为1个酶活力单位(U)。 5.1DNS法测CMC酶活实验方法:在试管中加入02mL的粗酶液，2mL的CMC液(浓度为1%)和2mL的醋酸缓冲液(pH为48)，40水浴1h。 接着往试管中加入DNS显色液2mL，再放进沸水中水浴10min，然后定容到15mL，最后用分光光度计测其在540nm下的OD值。 计算纤维素酶类的活性单位依据以下公式:纤维素酶活力=(bx+a)n1000/02T(U/g)式中x:样品OD值的平均值;b、a:由葡萄糖浓度和相应的OD值通过回归方程求得;n:酶液的稀释倍数;T:酶促反应的时间;02:所加酶液的量。 6.产油脂的纤维素酶产生菌检测近几年来产油微生物的研究越来越引起人们的关注。 如果一株菌既产纤维素酶又产油脂，那么它的应用价值将会大大提高。 因此本文也对筛得的产纤维素酶真菌进行了产油脂的检测。 所用的方法为苏丹混和液染色法。 6.1检测方法苏丹混合液染色法:取PDA液体培养基发酵培养的菌丝少许，置10mL小烧杯中，吸干液体培养基，加人苏丹混和液12mL于室温染色5min，取出菌丝于水中洗涤5mi