分子进化分析与相关分析软件的应用

分子进化分析与相关分析软件的应用 生命科学学院2005 4 内容提要 分子进化分析介绍系统发育树重建方法Phylip软件包在分子进化分析中的应用PAUP 在分子进化分析中的应用 内容提要 分子进化分析介绍系统发育树重建方法Phylip软件包在分子进化分析中的应用PAUP 在分子进化分析中的应用 从物种的一些分子特性出发 从而了解物种之间的生物系统发生的关系 蛋白和核酸序列通过序列同源性的比较进而了解基因的进化以及生物系统发生的内在规律 分子进化研究的目的 系统发育树是什么 对一组实际对象的世系关系的描述 如基因 物种等 一个系统发育树 末端 物种 顶端 中间节点 中间枝条 根 末端分支 叶子 节点 A B C D E F G 树只代表分支的拓扑结构 F G C D E A B 分子进化研究的基础 假设 核苷酸和氨基酸序列中含有生物进化历史的全部信息 在各种不同的发育谱系及足够大的进化时间尺度中 许多序列的进化速率几乎是恒定不变的 分子钟理论 1965 分子进化研究的基础 理论 虽然很多时候仍然存在争议 但是分子进化确实能阐述一些生物系统发生的内在规律 分子进化研究的基础 实际 从一个分歧数据可以推测其他 序列分歧度 分歧时间 x 分子钟理论 直系同源 orthologs 同源的基因是由于共同的祖先基因进化而产生的 旁系同源 paralogs 同源的基因是由于基因复制产生的 以上定义源自Fitch W M 1970 Distinguishinghomologousfromanalogousproteins Syst Zool 19 99 113 直系同源与旁系同源 paralogs orthologs paralogs orthologs ErikL L SonnhammerOrthology paralogyandproposedclassificationforparalogsubtypesTRENDSinGeneticsVol 18No 12December20020168 9525 02 seefrontmatter 2002ElsevierScienceLtd Allrightsreserved 以上两个概念代表了两个不同的进化事件用于分子进化分析中的序列必须是直系同源的 才能真实反映进化过程 趋同进化的基因 geneshaveconvergedfunctionbyseparateevolutionarypaths 异源基因或水平转移基因 xenologousorhorizontallytransferredgenes Bacterium1 Bacterium3 Bacterium2 Eukaryote1 Eukaryote4 Eukaryote3 Eukaryote2 Bacterium1 Bacterium3 Bacterium2 Eukaryote1 Eukaryote4 Eukaryote3 Eukaryote2 Phylogramsshowbranchorderandbranchlengths进化树 有分支和支长信息 2 进化分支图 进化树 Cladogramsshowbranchingorder branchlengthsaremeaningless进化分支图 只用分支信息 无支长信息 Rootedbyoutgroup archaea archaea archaea bacteriaoutgroup root eukaryote eukaryote eukaryote eukaryote 无根树 archaea archaea archaea Monophyleticgroup 单源群 Monophyleticgroup 3 有根树 无根树 外围群 有根树 外围群 4 基因树 物种树 Weoftenassumethatgenetreesgiveusspeciestrees a b c A B D Genetree Speciestree 内容提要 分子进化分析介绍系统发育树重建方法Phylip软件包在分子进化分析中的应用PAUP 在分子进化分析中的应用 系统发育树重建分析步骤 多序列比对 自动比对 手工比对 建立取代模型 建树方法 建立进化树 进化树评估 BioinformaticsSequenceandGenomeAnalysisDavidW MountChapter6PhylogeneticPrediction TheSourceBelowComeFrom 系统发育树重建的基本方法 最大简约法 maximumparsimony MP 距离法 distance 最大似然法 maximumlikelihood ML 最大简约法 MP 最大简约法 maximumparsimony MP 最早源于形态性状研究 现在已经推广到分子序列的进化分析中 最大简约法的理论基础是奥卡姆 Ockham 哲学原则 这个原则认为 解释一个过程的最好理论是所需假设数目最少的那一个 对所有可能的拓扑结构进行计算 并计算出所需替代数最小的那个拓扑结构 作为最优树 序列个数与树的个数的关系 信息位点 Sitesareinformative 所谓信息位点 它必须在至少2个分类群中具有相同的序列性状 信息位点是指那些至少存在2个不同碱基且每个不同碱基至少出现两次的位点 优点 最大简约法不需要在处理核苷酸或者氨基酸替代的时候引入假设 替代模型 此外 最大简约法对于分析某些特殊的分子数据如插入 缺失等序列有用 最大简约法 MP 缺点 在分析的序列位点上没有回复突变或平行突变 且被检验的序列位点数很大的时候 最大简约法能够推导获得一个很好的进化树 然而在分析序列上存在较多的回复突变或平行突变 而被检验的序列位点数又比较少的时候 最大简约法可能会给出一个不合理的或者错误的进化树推导结果 最大简约法 MP 距离法 距离法又称距离矩阵法 首先通过各个物种之间的比较 根据一定的假设 进化距离模型 推导得出分类群之间的进化距离 构建一个进化距离矩阵 进化树的构建则是基于这个矩阵中的进化距离关系 计算序列的距离 建立距离矩阵 通过距离矩阵建进化树 一种简单的距离矩阵 由进化距离构建进化树的方法有很多 常见有 1 Fitch MargoliashMethod FM法 2 Neighbor JoiningMethod NJ法 邻接法 3 NeighborsRelatonMethod 邻居关系法 4 UnweightedPairGroupMethod UPGMA法 通过矩阵建树的方法 Fitch Margoliash方法 FM法 DE距离 d e 1 D到ABC间的平均距离 d m 2 E到ABC间的平均距离 e m 3 2 3 1 d 4 e 6 c g e d 2 19 1 c f a b 2 40 2 e d 2 a b 2 f g 41 2 1 2 3 得 c 9 c g e d 2 19 e d 2 5 c 9 则g 5 由 a b 2 f g d e 2 41得 f 20由 a f c 39得 a 10 则b 12 1 找出关系最近的序列对 如A和B2 将剩余的序列作为一个简单复合序列 分别计算A B到所有其他序列的距离的平均值3 用这些值来计算A和B间的距离4 将A B作为一个单一的复合序列AB 计算与每一个其他序列的距离 生成新的距离矩阵5 确定下一对关系最近的序列 重复前面的步聚计算枝长7 从每个序列对开始 重复整个过程8 对每个树计算每对序列间的预测距离 发现与原始数据最符合的树 Fitch Margoliash方法 FM法 小结 NJ 邻接法 任意两个节点选为相邻序列的总支长计算公式 把A B看成一个新的复合序列 构建一个新的距离表 重复以上过程 邻居关系法 AB组合出现3次 DE组合出现3次 CD AC BC组合各一次 则AB和DE各为两对关系最近的邻居 关系最近的邻居作为邻居的次数最多 将邻居看成一个新的复合序列 重复这个过程 UPGMA法 d e 10 2 5 c 19 2 9 5g c d 9 5 5 4 5 a b 22 2 11 f1 a f2 c 40 5 2 20 25f1 9 25 f2 11 75 距离矩阵的改进 将序列相似性转化为距离记分 蛋白质的正规化相似性记分 Sreal 实际的相似性记分值Srand 背景平均记分值 随机情况下可能的记分值 Sident 该长度下相似性记分的预测值 P 0 007时Srand的值为 其中 K由打分矩阵给出对于长度为m和n的序列的排列的预测值Sident为 Sii为匹配记分 Pi为每种氨基酸的比例 n为较短序列的长度 修正后的相似值S表示为 一旦得到S值 就可以用1 S计算序列的距离 实际中的距离计算则用下面的式子 最大似然法 ML 最大似然法 maximumlikelihood ML 最早应用于系统发育分析是在对基因频率数据的分析上 后来基于分子序列的分析中也已经引入了最大似然法的分析方法 最大似然法分析中 选取一个特定的替代模型来分析给定的一组序列数据 使得获得的每一个拓扑结构的似然率都为最大值 然后再挑出其中似然率最大的拓扑结构作为最优树 在最大似然法的分析中 所考虑的参数并不是拓扑结构而是每个拓扑结构的枝长 并对似然率球最大值来估计枝长 最大似然法 ML 最大似然法的建树过程是个很费时的过程 因为在分析过程中有很大的计算量 每个步骤都要考虑内部节点的所有可能性 最大似然法是一个比较成熟的参数估计的统计学方法 具有很好的统计学理论基础 在当样本量很大的时候 似然法可以获得参数统计的最小方差 只要使用了一个合理的 正确的替代模型 最大似然法可以推导出一个很好的进化树结果 最大似然法 ML 碱基变化的通用模型 L Tree1 L1 L2 L6 L Tree2 L1 L2 L6 似然值最大 即SUM最大的拓扑树则为最优树 由于最大似然法的分析过程需要耗费较多的时间 针对这种情况 发展出了许多优化的可以加快最大似然法寻找最优树的搜索方法 如启发式搜索 分枝交换搜索等 最大似然法具有坚实的统计学理论基础 充分的使用了分析序列中的信息资源 只要采用了合理的替代模型 可以得出很好的进化树分析结果 最大似然法 ML 选择外类群 Outgroup 选择一个或多个已知与分析序列关系较远的序列作为外类群外类群可以辅助定位树根外类群序列必须与剩余序列关系较近 但外类群序列与其他序列间的差异必须比其他序列之间的差异更显著 bacteriaoutgroup eukaryote eukaryote eukaryote eukaryote archaea archaea archaea 外围群 进化树的可靠性分析 自展法 BootstrapMethod 从排列的多序列中随机有放回的抽取某一列 构成相同长度的新的排列序列重复上面的过程 得到多组新的序列对这些新的序列进行建树 再观察这些树与原始树是否有差异 以此评价建树的可靠性 原始排列AlphaAACAACBetaAACCCCGammaACCAACDeltaCCACCAEpsilonCCAAAC Bootstrap1AlphaACAAACBetaACCCCCGammaACAAACDeltaCACCCAEpsilonCAAAACBootstrap2AlphaAAAACCBetaAACCCCGammaCCAACCDeltaCCCCAAEpsilonCCAACCBootstrap3AlphaACAAACBetaACCCCCGammaCCAAACDeltaCACCCAEpsilonCAAAAC 内容提要 分子进化分析介绍系统发育树重建方法Phylip软件包在分子进化分析中的应用PAUP 在分子进化分析中的应用 常见的分子进化分析程序 1 Phylip由华盛顿大学遗传学系开发 是一个免费的系统发育分析软件包 可以通过以下地址下载 washington edu phylip html2 PAUP 最早是在苹果机上开发的具有菜单界面的进化分析软件 早先版本只有MP法 后续版本已经包括距离法和ML法 现今有mac win linux等多种版本 该软件不是免费软件 使用者需要向开发者购买 Phylip软件包介绍 Phylip是一个免费的系统发生 phylogenetics 分析软件包 以下链接可以下载 由华盛顿大学遗传学系开发 1980年首次公布 目前的版本是3 6 2000年6月 Phylip软件包介绍 Phylip包含了35个独立的程序 这些独立的程序都实现特定的功能 这些程序基本上包括了系统发生分析的所有方面 Phylip有多种不同平台的版本 包括windows Macintosh DOS Linux Unix和OpenVMX Phylip是目前最广泛使用的系统发生分析程序 主要包括一下几个程序组 分子序列组 距离矩阵组 基因频率组 离散字符组 进化树绘制组 Phylip软件包介绍 分子序列组 1 蛋白质序列 protpars proml promlk protdist2 核酸序列 dnapenny dnapars dnamove dnaml dnamlk dnainvar dnadist dnacomp Phylip软件包分组介绍 距离矩阵组 Fitch kitsch neighbor基因频率组 Gendist contml离散字符组Pars mix move penny dollop dolmove dolpenny clique factor Phylip软件包分组介绍 进化树绘制组 drawtree drawgram其他 restdist restml seqboot contrasttreedist consense retree Phylip软件包分组介绍 Phylip软件包的文档是非常详细的 对于每个独立的程序 都有一个独立的文档 详细的介绍了该程序的使用及其说明 此外 Phylip软件包还包括程序的源代码 c语言 Phylip软件包的文档 Phylip软件包的应用 1 根据你的分析数据 选择适当的程序如 你分析的是DNA数据 就在核酸序列分析类中选择程序 dnapenny dnapars dnamove dnaml dnamlk dnainvar dnadist dnacomp 如果分析的是离散数据 如突变位点数据 就在离散字符组里面选择程序 2 选择适当的分析方法如你分析的是DNA数据 可以选择简约法 DNAPARS 似然法 DNAML DNAMLK 距离法等 DNADIST Phylip软件包的应用 3 进行分析选择好程序后 执行 读入分析数据 选择适当的参数 进行分析 结果自动保存为outfile outtree Phylip软件包的应用 Outfile是一个记录文件 记录了分析的过程和结果 可以直接用文本编辑器 如写字板 打开 outtree是分析结果的树文件 可以用phylip提供的绘树程序打开查看 也可以用其他的程序来打开 如treeview Phylip软件包的应用 出发数据 已经排列好的蛋白序列 重构算法 距离法 protdist exe 最大简约法 protpars exe 最大似然法 proml exe 统计分析 拨靴法 bootstrap 实际应用 从蛋白序列推导进化树 实际操作 Phylip软件包中的每个分析程序都是一个独立的应用程序 我们选择好了分析算法后 按一定的顺序组合使用选择的程序 就可以获得按选择的算法分析的结果 进化树 例子 从我们刚刚通过clustal比对获得的蛋白序列推测进化树 选择方法 距离法 protdist exe 第一步 双击执行protdist exe 根据提示输入分析的文件名 程序默认是infile 第二步 设定各个参数 执行程序 获得距离矩阵数据输出文件outfile 第三步 选择通过距离矩阵推测进化树的算法 fitch exe kotsch exe neighbor exe 第四步 将刚获得的输出文件改名为infile 执行选择的推测算法 neighbor exe 设置好参数后执行程序 获得outfile和outtree两个结果输出 获得的结果文件中 outtree文件是一个树文件 可以用treeview等软件打开 outfile是一个分析结果的输出报告 包括了树和其他一些分析报告 可以用记事本直接打开 outfile outtree 加入统计分析 bootstrap 我们刚刚获得的进化树是纯粹的根据先前获得的排列数据所推导出来的 有很多可能使得这个树并不一定可靠 1 测序的出错 2 多序列比对算法本身的问题 3 其他的问题 我们可以引进一些统计分析来寻找更优的进化树最常见的就是bootstrap分析 Bootstrap分析 Phylip软件包中有两个用于执行bootstrap分析的程序 seqboot exe consence exe 分析过程 1 Seqboot产生大量的数据组2 应用选择的算法对产生的数据组进行分析 3 由consence获得最优树 内容提要 分子进化分析介绍系统发育树重建方法Phylip软件包在分子进化分析中的应用PAUP 在分子进化分析中的应用 PAUP 的使用 PAUP 的数据格式 Nexus NEXUSbegintaxa dimensionsntax 12 taxlabelsLemur catta Tarsius syrichta end begincharacters dimensionsnchar 898 formatmissing gap matchchar interleavedatatype dna optionsgapmode missing matrixLemur cattaAAGCTTCATAGGAGCAACCATTCTAATAATCGCACATGGCCTTACATCATCCATATTATTHomo sapiensAAGCTTCACCGGCGCAGTCATTCTCATAATCGCCCACGGGCTTACATCCTCATTACTATTPanAAGCTTCACCGGCGCAATTATCCTCATAATCGCCCACGGACTTACATCCTCATTATTATTGorillaAAGCTTCACCGGCGCAGTTGTTCTTATAATTGCCCACGGACTTACATCATCATTATTATTPongoAAGCTTCACCGGCGCAACCACCCTCATGATTGCCCATGGACTCACATCCTCCCTACTGTTHylobatesAAGCTTTACAGGTGCAACCGTCCTCATAATCGCCCACGGACTAACCTCTTCCCTGCTATT beginassumptions charsetcoding 2 457660 896 charsetnoncoding 1458 659897 898 charset1stpos 2 457 3660 896 3 charset2ndpos 3 457 3661 896 3 charset3rdpos 4 457 3662 3 exsetcoding noncoding exsetnoncoding coding usertype2 1 4 weightstransversions2timestransitions acgt a 212 c 2 21 g 12 2 t 212 usertype3 1 4 weightstransversions3timestransitions acgt a 313 c 3 31 g 13 3 t 313 taxsethominoids Homo sapiensPanGorillaPongoHylobates end beginpaup constraintsch Homo sapiens Pan constraintschg Homo sapiens Pan Gorilla end PAUP 的数据格式 Nexus 主要包括taxa characters assumptions sets trees codons distances paup八个数据块 对于一个常规的分析 taxa characters块是必须的 而分析的命令可以通过菜单操作 mac 或者键盘命令 win linux 也可以在nexus文件中加入paup命令块 1 TAXA块主要是定义所分析的数据 如分子序列 个数 以及这些数据的名称 如物种名称 2 CHARACTERS块主要是定义数据矩阵 如多序列比对结果 和其他一些相关的信息 如序列特征值 序列有效区域等 PAUP 的Nexus的文件块 3 ASSUMPTIONS块定义了对数据的一些设定 如那些特征值是不需考虑的 怎么处理gap这个特征值等 用户自定义的一些数据也放在这块 如自定义的打分矩阵 4 SETS块定义了一系列的数据组 如特征值组 物种组等 这些设置都是为了方便后续的分析 5 TREES块定义了用户自己设定的树 用于后续的分析 如作为限制树等 6 CODONS块定义了遗传密码子的一些信息 如编码的位置 哪些是编码的 密码子的位点等 7 DISTANCES块定义了一些距离矩阵 8 PAUP块是软件的核心块 所有的分析命令和一些参数设置 90多个命令 都放在这一块 这一块并不是分析输入数据所必须的 这些命令可以写在这一块 文件中 这时载入文件时就开始根据该块的命令进行分析 有点类似dos的批处理过程 当然也可以通过键盘命令逐一敲入 交互进行分析 批处理的方式在分析过程比较长 耗时比较久的时候是比较有用的 当然在进行处理之前一定要先保证该批处理过程没有问题 一个PAUP 的基本分析实例 1 通过clustalw clustalx获取一个多序列比对结果 可能要经过人工调整 推荐用bioedit做辅助编辑器 保存成nexus格式的文件 或者用其他格式转换软件转换成nexus格式 paup 中也有一个tonexus命令可以将其他格式 包括phylip GCG等格式 的文件转换为nexus格式的文件 2 在PAUP 程序中读入数据 Nexus格式 输入命令的地方 打开文件的窗口 程序自带的测试数据 执行该文件还是编辑该文件 执行文件时将文件数据读入程序 编辑文件则调用一个文本编辑器 如果不是nexus格式 执行时候会出错 然后调用文本编辑器打开 3 数据输入完成 开始分析 两个很有用的命令 显示所有的命令命令 显示命令的所有参数 分析 开始一 1 开始之前打开记录文件 跟踪整个分析过程 命令 logstart 停止 logstop 2 设置数据哪些用于分析 如 includecoding only excludecoding only 哪些物种要分析 删除不要的 如 delete1 或者deletetaxa name undelete1 分析 开始二 3 确定建树方法最大简约法 最大似然法 距离法 命令 Setcriterion parsimony likelihood distance 分析 建树一 4 确定其他参数Set 查看其他参数的设置 改为自己所需要的设置 如 setmaxtree 10000increase noautoclose yes 分析 建树二 5 确定搜索方法 对于距离法不适用 穷尽法 alltrees分支跳跃查找 bandb启发式搜索 hsearch其他 puzzle 只在likelihood时有效 分析 建树三 6 开始搜索树之前 设置各个建树方法的参数 距离法 dset如 dsetdistance tamneinegbrlen allow最大简约法 pset如psetcollapse nogapmode newstate最大似然法 lset如 lsetnst 6clock yes 分析 建树四 7 再次确认参数是否要设置外围群 outgroup 如outgroup1 2 或者outgrouptaxa set 其他参数 分析 建树五 7 开始搜索树距离法 NJ UPGMA最大简约法 最大似然法Hsearch 参数是否要更改 如 hsearchandseq randomswap spr 分析 建树六 8 进化树的评估选择评估方法 Bootstrap 自展法 用的最多 是对进化树重新取样的评估方法 可以对距离法 简约法 似然法以及衍生出的任何其他方法构建的进化树进行评估 其分析结果是一组数字 这个数字描述了进化树进化分支的支持比例 也就是进化树分支的稳健性 分析 树评估一 分析 树评估二 未经过bootstrap的树 Bootstrap后的树 BOOTSTRAP options heuristic search options branch and bound search options 使用分支限制或者是启发式搜索的方法进行bootstrap分析 参数 BSEED integer value随机数种子 NREPS integer valuebootstrap重复的次数 默认值为100 SEARCH HEURISTIC BANDB FASTSTEP NJ UPGMA搜索方式 CONLEVEL integer valuebootstrap重复次数的最低比率 默认为50 KEEPALL YES NO WTS IGNORE SIMPLE REPEATCNT PROPORTIONAL NCHAR CURRENT number of characters每次重复采样的数目 GRPFREQ YES NO显示bootstrap分割频率 TREEFILE bootstrap tree 树的文件 FORMAT NEXUS ALTNEXUS FREQPARS PHYLIP HENNIG BRLENS YES NO分支的长度 REPLACE YES NO CUTOFFPCT integer value定义显示的最低bootstrap分割频率 Examplebootstrapnreps 200treefile boot tresearch heuristic addseq random 分析 树评估三 PAUP 中的bootstrap命令 对折分析 jackknife 跟bootstrap类似 只是在对原始数据取样的时候不会取重复的数据位点 因为它重复取样的时候是在原始数据中除去一个或者多个比对位点 对折分析得出的结果和bootstrap是一样的 命令和参数都类似 用的比bootstrap少很多 分析 树评估四 JACKKNIFE options heuristic search options branchand bound search options 对折分析 PCTDELETE real value每个对折分析循环中删除的dataset百分数 JSEED integer value随机数种子 NREPS integer value对折循环次数 SEARCH HEURISTIC BANDB FASTSTEP NJ UPGMA树的搜索方法 NJ和UPGMA仅在最优规则为distance时才可用 RESAMPLE NORMAL JAC CONLEVEL integer valueboostrap中出现的最小比例 最为保留group 默认为50 即50 KEEPALL YES NO低于conlevel的树 若与一致树兼容 也保留 WTS IGNORE SIMPLE REPEATCNT PROPORTIONAL GRPFREQ YES NO显示对折分区频率 TREEFILE tree FORMAT NEXUS ALTNEXUS FREQPARS PHYLIP HENNIG REPLACE YES NO CUTOFFPCT integer value对折频率表中显示的最小频率 ExampleJACKKNIFEnreps