生化-第16章 rna的生物合成

第 十六 章,RNA的生物合成（转录）RNA Biosynthesis, Transcription,主讲人：董俊红,1.掌握转录和复制的异同点；不对称转录、模板链和编码链的概念。2.掌握原核生物RNA聚合酶的全酶及核心酶的组成3.熟悉真核生物的RNA聚合酶的分类，作用特点以及各 自相应的产物；模板与酶的辨认结合，启动子的概念。4.熟悉原核生物的转录起始，转录的方向，原核生物的 转录终止分两种方式。5.熟悉原核生物RNA合成的过程6.熟悉真核生物顺式作用元件7.熟悉真核生物的转录后的修饰。8.熟悉反式作用因子的概念及种类。了解真核生物RNA 合成的过程。9. 了解槌头结构的作用特点。,目的要求,在生物界，RNA合成有两种方式,一是DNA指导的RNA合成，也叫转录，此为生物体内的主要合成方式。另一种是RNA指导的RNA合成(RNA-dependent RNA synthesis)，也叫RNA复制(RNA replication), 由RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase)催化，常见于病毒。,转录 (transcription) 是生物体以DNA为模板合成RNA的过程 。,转录产物除mRNA、rRNA 和tRNA外，在真核细胞内还有snRNA、miRNA等非编码RNA。,转录,DNA复制与转录的比较,复 制 转 录,相同点,都是酶促的核甘酸聚合过程 以DNA为模板 遵循碱基配对原则 都需依赖DNA的聚合酶 聚合过程都是生成磷酸二酯键 新链合成方向为53,复制和转录的区别,原核生物转录的模板和酶Templates & Enzymes in prokaryotic transcription,第一节,参与转录的物质,底物: NTP (ATP, UTP, GTP, CTP) 模板: 单链DNA酶: RNA聚合酶(RNA polymerase, RNA-pol)其他蛋白质因子,合成方向: 53，核苷酸间的连接方式为 3，5-磷酸二酯键。,不对称转录(asymmetric transcription): 包括两方面含义: 在DNA双链上，一股链可转录，另一股链不转录；模板链并非总是在同一单链上。,转录的模板是DNA双链中一股单链的不同区段,能转录出RNA的DNA区段，称为结构基因(structural gene)。,一、原核生物转录的模板,53,35,模板链,编码链,编码链,模板链,结构基因,不对称转录,5GCAGTACATGTC 3,3 c g t g a t g t a c a g 5,5GCAGUACAUGUC 3,NAla Val His Val C,编码链,模板链,mRNA,蛋白质,转录,翻译,DNA双链中按碱基配对规律能指引转录生成RNA的一股单链，称为模板链(template strand)，也称作有意义链或Watson链。相对的另一股单链是编码链(coding strand)，也称为反义链或Crick链。,DNA,这是一种不同于引物酶的依赖DNA的RNA聚合酶（DDRP）。该酶在单链DNA模板以及四种核糖核苷酸存在的条件下，不需要引物，即可从53聚合RNA。,二、RNA合成由RNA聚合酶催化,（一）RNA聚合酶能从头启动RNA链的合成,( NMP )n + NTP ( NMP ) n+1 + PPi,RNA,延长的RNA,DNA聚合酶在启动DNA链延长时需要引物存在，而RNA聚合酶不需要引物就能直接启动RNA链的延长。RNA聚合酶和双链DNA结合时活性最高，但是只以双链DNA中的一股DNA链为模板。 RNA聚合酶和DNA的特殊序列启动子(promoter)结合后，就能启动RNA合成。,DNA依赖的RNA聚合酶催化RNA合成的机制,a 36512 决定哪些基因被转录,b 150618 结合核甘酸，催化磷酸二酯键,b 155613 结合DNA模板，开链,s 70263 辨认起始点,亚基 分子量 功能,（二）原核生物RNA聚合酶由多个亚基组成,核心酶 (core enzyme),全酶 (holoenzyme),原核生物的RNA聚合酶,原核生物有多种亚基，本质是蛋白质,70：一般情况下起作用的是 （辨认典型转录起始点）,32：是辨认热休克蛋白基因（hsp)转录 起始点的蛋白质。,热休克蛋白(Hsp):环境温度升高时才合成的蛋白质。,RNA聚合酶全酶在转录起始区的结合,三、RNA聚合酶结合到DNA的启动子上启动转录,转录是不连续、分区段进行的。每一转录区段可视为一个转录单位，称为操纵子(operon)。操纵子包括若干个结构基因及其上游(upstream)的调控序列。,调控序列中的启动子是RNA聚合酶结合模板DNA的部位，也是控制转录的关键部位。原核生物以RNA聚合酶全酶结合到DNA的启动子上而起动转录，其中由亚基辨认启动子，其他亚基相互配合。 对启动子的研究，常采用一种巧妙的方法即RNA聚合酶保护法。,RNA聚合酶保护法,4060bp,结构基因,终止点,10,-10,TTGACA,TATAAT,转录开始,翻译开始,开始转录生成 RNA5-端第一个核苷酸,-35,（Pribnow box）,RNA-pol辨认结合区,12/50,被RNA聚合酶辨认的区段就是位于转录起始点-35区的TTGACA序列。 酶与该区松弛结合后，即滑动至-10区的TATAAT序列（Pribnow盒）紧密结合 ，并启动转录。,RNA聚合酶全酶在转录起始区的结合:,原核生物的转录过程The Process of Transcription in Prokaryote,第二节,原核生物的转录过程可分为转录起始、转录延长和转录终止三个阶段。,（一）转录起始,转录起始需解决两个问题：RNA聚合酶必须准确地结合在转录模板的起始区域。DNA双链解开，使其中的一条链作为转录的模板,形成转录起始复合物。,一、转录起始需要RNA聚合酶全酶, DNA双链局部解开（亚基催化) 。, RNA聚合酶全酶(2)与模板辨认结合。,转录起始过程：,解链范围比复制时小，为17bp左右。,RNA-pol 亚基辨认结合-35区，在-10区紧密结合，跨入转录起始点。, 在RNA聚合酶作用下发生第一次聚合反应（亚基催化) ，形成转录起始复合物。,5-pppG -OH + NTP 5-pppGpN - OH 3 + ppi,RNApol (2) - DNA - pppGpN- OH 3,RNA-pol催化与模板配对的两个游离的NTP聚合，不需引物。形成5-pppGpN-OH-3的结构。,(GTP),(4)合成第一个磷酸二酯键后， 亚基脱落。,E.coli的转录起始和延长,2. DNA双链局部解开，形成开放转录复合体(open transcription complex) ；,1. RNA聚合酶全酶(2)与模板结合，形成闭合转录复合体(closed transcription complex) ；,3. 在RNA聚合酶作用下发生第一次聚合反应，形成转录起始复合物：,RNApol (2) - DNA - pppGpN- OH 3,转录起始复合物:,5-pppG -OH + NTP 5-pppGpN - OH 3 + ppi,转录起始过程：,1. 亚基脱落，RNApol聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿着DNA模板前移；,2. 在核心酶作用下，按模板的指引，NTP不断聚合，RNA链不断延长。（A U）,(NMP) n + NTP (NMP) n+1 + PPi,3.转录复合物: RNA-pol（核心酶)-DNA -RNA,二、 RNA pol核心酶独立延长RNA链,大肠杆菌的转录泡局部结构示意,转录空泡(transcription bubble)：,RNA-pol （核心酶） DNA RNA,RNA聚合酶全酶在转录起始区的结合,转录延长以下特点, 核心酶负责RNA链延长反应； RNA链从5-端向3 -端延长，新的核苷酸都是加 到3-OH上； 对DNA模板链的阅读方向是3-端向5-端; 合成区域存在着动态变化的8bp 的RNA-DNA杂合双链； 模板DNA的双螺旋结构随着核心酶的移动发生解链和再复合的动态变化。,转录过程中DNA的超螺旋结构变化,转录过程中DNA的超螺旋结构变化,RNA,22/50,G C A T A U,新合成的RNA的5端伸出空泡外,5,模板链,DNA/DNA双链比DNA/RNA杂化双链稳定。,3,5,3,DNA,三、原核生物转录延长与蛋白质的翻译同时进行,核糖体,RNA,RNA聚合酶,小黑点是核蛋白体,说明转录和翻译同步进行.,依赖因子的转录终止非依赖因子的转录终止,四、原核生物转录终止分为依赖因子与非依赖因子两大类,转录终止指RNA聚合酶在DNA模板上停顿下来不再前进，转录产物RNA链从转录复合物上脱落下来。,依据是否需要蛋白质因子的参与，原核生物转录终止分为：,因子,因子识别结合转录产物RNA链,特别是对富含C的结合力最强.,功能,ATP酶活性,解螺旋酶活性,能控制转录终止的蛋白质,1. 依赖 Rho（ ）因子的转录终止,A T P,结合后因子和RNA聚合酶都可能发生构象变化，从而使RNA聚合酶停顿，解螺旋酶的活性使RNADNA杂化链解链，转录的RNA释放出来而终止转录,2非依赖因子的转录终止：,茎环结构使转录终止的机理,使RNA聚合酶变构，转录停顿；使转录复合物趋于解离，RNA产物释放。,真核生物RNA的生物合成The Biosynthesis of Eukaryote RNA,第三节,一、 真核生物有三种DNA依赖的RNA聚合酶,真核生物具有3种不同的RNA聚合酶:,RNA聚合酶（RNA Pol）RNA聚合酶（RNA Pol）RNA聚合酶（RNA Pol ）,一 真核生物的RNA聚合酶,种类,对鹅膏蕈碱,的反应,45S,-,rRNA,hnRNAIncRNApiRNAmiRNA,5S,-,rRNA,tRNA,snRNA,耐受,极敏感,中度敏感,转录产物,所有真核生物的RNA聚合酶都有两个不同的大亚基和十几个小亚基.RNA聚合酶由12个亚基组成.RNA聚合酶最大亚基的羧基末端有一段共有序列(consensus sequence)为Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser的重复序列片段，称为羧基末端结构域(carboxyl-terminal domain, CTD)。 CTD对于维持细胞的活性是必需的。,结构基因,-GCGC-CAAT-TATA,真核生物启动子保守序列,1. 转录前起始复合物的形成,真核生物RNA聚合酶转录的基因结构与功能,其他调控元件,增强子或 沉默子,CAAT盒 GC盒,TATA 盒,结构基因,+1,调节基因表达水平,决定基因表达的时空特异性等。激素，金属离子，小分子化合物等反应元件。,决定基因表达的基础水平,与RNA poly II 结合，决定转录起始点的精确定位,使转录增强或减弱,维持基本的表达水平,DNA分子上具有可影响或调控转录的各种组分统称为顺式作用元件（cis-acting element）。,原核与真核生物转录单位的区别：,原核生物的转录单位是操纵子：由一个调控序列和若干个结构基因组成。,真核生物的转录单位是一个基因：由顺式作用元件和一个结构基因组成。,真核生物RNA聚合酶转录的基因及其转录起始上游序列,能直接、间接辨认和结合转录上游区段DNA的蛋白质，现已发现数百种，统称为反式作用因子(trans-acting factors)。 反式作用因子中，直接或间接结合RNA聚合酶的，则称为通用转录因子（general transcription factor）或基本转录因子（basal transcription factor）,参与RNA-pol转录的TF,蛋白激酶活性，使,CTD,磷,酸化,TF,H,ATPase,57,（,a,）,34,（,b,）,TF,E,解螺旋酶,30,，,74,TF,F,促进,RNA,-,pol,结合及作,为其他因子结合的桥梁,33,TF,B,稳定,TF,D,-,DNA,复合物,12,，,19,，,35,TF,A,辅助,TBP,-,DNA,结合,TAF*,结合,TATA,盒,TBP* 38,TF,D,功,能,转录因子,蛋白激酶活性，使,CTD,磷,酸化,TF,H,ATPase,TF,E,解螺旋酶,TF,F,促进,RNA,-,pol,结合及作,为其他因子结合的桥梁,TF,B,稳定,TF,D,-,复合物,TF,A,辅助,TBP,-,DNA,结合,TBP结合,TATA,盒,TF,D,功,能,转录因子,闭合转录复合体的形成步骤, 由TFIID中的TBP识别TATA盒，并在TAFs的协助下结合到启动子区，然后TFIIB与TBP结合，同时TFIIB也能与DNA结合，TFIIA可以稳定与DNA结合的TFIIB-TBP复合体； TFIIB-TBP复合体与RNA pol II-TFIIF复合体结合，此举可降低RNA pol II 与DNA的非特异部位的结合，协助RNA pol II 靶向结合启动子； TFIIE和TFIIH加入，形成闭合复合体，装配完成。,TFF,A,B,由RNA-Pol 催化转录的PIC,H,E,TBP,TAF,TFD-A-B-DNA复合物,TATA,A,B,TBP,TAF,TATA,H,E,PIC组装完成，TFH使CTD磷酸化,真核RNA聚合酶与通用转录因子的作用过程,（二）少数几个反式作用因子的搭配启动特定基因的转录,为了保证转录的准确性，不同基因需不同转录因子。拼板理论(piecing theory) ：少数几个反式作用因子（主要是可诱导因子和上游因子）之间互相作用，再与基本转录因子、RNA聚合酶搭配而有针对性地结合、转录相应的基因。,真核生物转录延长过程与原核生物大致相似，但因有核膜相隔，没有转录与翻译同步的现象。,RNA-pol前移处处都遇上核小体。,转录延长过程中可以观察到核小体移位和解聚现象。,三 、真核生物转录延长过程中没有转录与翻译同步的现象,RNA-Pol,RNA-Pol,RNA-Pol,核小体,转录延长中的核小体移位,转录方向,5-AAUAAA-,5 -AAUAAA-,核酸酶,-GUGUGUG,RNA-pol,AATAAA GTGTGTG,转录终止的修饰点,5,5,3,3,3加尾,AAAAAAA 3 mRNA,转录终止, 和转录后修饰密切相关。,四、真核生物的转录终止和加尾修饰同时进行,真核生物RNA的加工和降解 The Processing and Degradation of Eukaryotic RNA,第四节,一、真核生物mRNA前体（ hnRNA）转录后修饰,（一）首、尾的修饰,在hnRNA 5端加上m7G,在hnRNA 3端加上poly A,（二）剪接（splicing）,剪去内含子，并接外显子,32/50,（一）前体mRNA在5-末端加入“帽”结构,大多数真核mRNA的5-末端有7-甲基鸟嘌呤的帽结构。这个真核mRNA加工过程的起始步骤由两种酶，加帽酶(capping enzyme)和甲基转移酶(methyltransferase)催化完成。,帽结构的生成过程,帽结构,帽结构的意义：,可以使mRNA免遭核酸酶的攻击；也能与帽结合蛋白质复合体(cap-binding complex of protein)结合，并参与mRNA和核糖体的结合，启动蛋白质的生物合成。,（二）前体mRNA在3-端特异位点断裂并加上多聚腺苷酸尾,尾部修饰是和转录终止同时进行的过程。poly A的有无与长短，是维持mRNA作为翻译模板的活性，以及增加mRNA本身稳定性的因素。一般真核生物在胞浆内出现的mRNA，其poly