基因芯片复习课件总结提纲

1 第一章第一章 生物芯片概述生物芯片概述 生物芯片概念生物芯片概念 生物芯片是将大量生物分子按预先设计的排列固定于一种载体表面 利用生物分 子的特异性亲和反应 来分析各种生物分子存在的量的一种技术 生物芯片的分类生物芯片的分类 根据生物芯片的结构特点 根据用途不同 二 生物芯片的研究概况二 生物芯片的研究概况 生物芯片的发展生物芯片的发展 最初级的生物芯片 DNA 芯片 1991 寡核苷酸芯片 1994 测序芯片 1995 cDNA 芯片 其他生物芯片 生物芯片技术研究存在的问题 重复性 稳定性 提高 灵敏度 增强 标准化 实现 设备及软件 完善 操作过程 简化 三 生物芯片技术的基础知识三 生物芯片技术的基础知识 生物芯片技术工作的总流程 生物芯片的制备 生物芯片技术主要包括四个基本技术环节 生物芯片技术主要包括四个基本技术环节 芯片制备 样品制备 生物分子反应 信号的检测与分析 生物芯片的制备步骤有哪些 分别有什么目的 生物芯片的制备步骤有哪些 分别有什么目的 基片处理 点样 固定 封闭 第二章第二章 核酸芯片核酸芯片 2 一 核酸芯片简介一 核酸芯片简介 概念 核酸芯片是指采用一定的技术将许多特定的 DNA 序列排列固定于固相支 持物表面 然后与标记的样品进行杂交 通过检测杂交信号来实现对生物样品的 快速 并行和高效的检测和分析 二 核酸芯片的载体二 核酸芯片的载体 载体概念 用于连接 吸附或包埋各种生物分子使其以水不溶性状态行使功能的 固相材料统称为载体 如何选择载体 载体表面必须具有可进行化学反应的活性基团 以便于生物分子进行偶联 使单位载体上结合的生物分子达到最佳容量 载体应当是惰性的和有足够的稳定性 载体具有良好的生物兼容性 以利于制作不同种类的芯片 载体类型 载体类型 玻片 硅片 硝酸纤维素膜 尼龙膜 塑料等 三 寡核苷酸芯片技术三 寡核苷酸芯片技术 oligonucleotide microarray oligochip 概念 寡核苷酸芯片是把寡核苷酸固定在玻片上 与荧光标记的待检 序列在一定条件下杂交 经洗涤后扫描获得检测信息 制作技术与原理 原位合成原理 略 合成后微点样原理合成后微点样原理 利用手工或自动点样装置将预先合成和纯化的寡核苷酸点在经特殊处理的载体上 即可 包括接触式与非接触式两种 主要用于中低密度芯片制备 点样方式及点样针点样方式及点样针 思考题 比较三种针的优缺点 使用裂缝针时 如果看到玻片上某些点没有点上 分析可能的原因 点印完以后 含有斑点的区域必须加以行列标志 为什么 如何保存 点样的后期处理 目的 为了使探针能与载体表面牢固结合 同时 避免在杂交过程中非特异性的 吸附对实验结果 特别是背景 造成影响 小结 寡核苷酸芯片的基本概念 寡核苷酸芯片的制备原理 光引导原位合成 点样针及点样过程 四 四 cDNA 微阵列芯片微阵列芯片 cDNA 是与 mRNA 互补的 DNA 分子 长约 0 2 5 0kb cDNA 微阵列芯片是由固定于基质材料上的 cDNA 片段组成的微阵列 待测样品 标记后与芯片上的探针分子杂交 通过荧光强度的检测对杂交结果进行分析 主要内容 cDNA 文库的构建文库的构建 提高 cDNA 文库构建的效率 cDNA 基因文库构建的步骤 细胞总 RNA 的提取和 mRNA 的分离 第一条 cDNA 合成 双链 cDNA 合成 双链 cDNA 克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖 cDNA 文库构建效率 cDNA 文库构建的效率低的表现 3 造成这种低效率的主要原因 如何提高 cDNA 文库构建的效率 表达谱基因芯片表达谱基因芯片 用来检测样本中 RNA mRNA 即基因表达 转录水平 的研 究芯片 将待测样品 处理组 与对照样品的 mRNA 以两种不同的荧光分子进行标记 然后同时与芯片的探针进行杂交 通过分析两种样品与探针杂交的荧光强度的比 值 来检测基因表达水平的变化 表达谱研究的方式 基因表达丰度的绝对检测 基因表达发生变化的相对检测 第三章第三章 蛋白芯片蛋白芯片 二 蛋白质芯片技术的概念 狭义的概念 蛋白质芯片是由固定于载体上的蛋白质微阵列组成 然后与要检测 的组织或细胞的混合物进行杂交 在通过自动化仪器分析得到的结果 广义的概念 能对蛋白质进行快速 并行分析的生物芯片都可称之为蛋白质芯片 三 蛋白质芯片的分类 根据应用目的 蛋白质功能芯片 研究 DNA protein RNA protein protein protein 等相互作用的的芯片 用来检测蛋白质的生物活性 蛋白质检测芯片 蛋白质分析芯片 蛋白质表达芯片 主要用于识别检测复杂生物样品溶液中的目标多肽 四 蛋白质芯片制备及分析 1 载体的选择 玻璃 胺反应性表面适用于蛋白的点样 巯基反应性表面适合免疫球蛋白 G 抗体的点样 疏水性表面 尼龙或硝酸纤维素 也适合作载体 但有更强的非特异性吸附 实验中较好的载体材料 Hydrogel 载体 聚丙烯酰胺为基质 FAST 以及 CAST 基片 固化尼龙或硝酸纤维素 2 探针的选择 狭义 蛋白质或多肽 广义 核酸 核酸 蛋白复合物或其他配基 3 探针的固定 样品在载体上排布的实现方式大多是先制备好蛋白质样品库 再通过点样系统实 现 一般不采用原位合成法 蛋白质的固定方法蛋白质的固定方法 1 物理吸附 2 蛋白分子与基片表面形成化学键 3 包埋 4 蛋白分子的表 面交联 4 生物分子杂交反应 缓冲液 温度 时间 离子强度 5 检测分析 在扫描前 基片应在空气中充分干燥 扫描和数据的分析与核酸微阵列相似 并遵循各自的流程 五 蛋白质芯片的应用 研究蛋白质的表达 研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用 检测蛋白与小分子物质的作用 例如蛋白质与 DNA RNA 分子等 第四章第四章 组织芯片组织芯片 一 组织芯片的概念及分类 组织芯片组织芯片 tissue chip 的概念 又称为组织微阵列的概念 又称为组织微阵列 tissue microarrays TMA 是将成百上千个不同组织标本按预先设计的排列固定在一张固相载体上形成组织 微阵列 用不同的基因探针或抗体与之杂交 以分析目的基因在相关的组织中表 达的差异性 组织芯片的分类 按照组织点样数目的不同 低密度 600 按照组织来源不同 人类组织芯片 动物组织芯片 4 植物组织芯片 二 组织芯片的制备 组织芯片的制备仪主要包括 操作平台 打孔采样装置 定位系统 打孔采样装置对供体组织蜡块进行采样 也可对受体蜡块进行打孔 定位装置可使受体蜡块线性移动 从而制备出孔径 孔距 孔深完全相同的组织 芯片蜡块 组织芯片的制备步骤 通过常规制作 H E 切片和显微镜检测分析来实现对典型病变部位所在石蜡块的 选择和定位 组织标本块的妥善保存 原因 有助于以后重新评估实验和利用相同的供体重建 TMA 保存组织标本块的基本信息 打孔仪不同孔径的优缺点分析 对组织芯片技术有效性的论证 组织芯片上微小的组织样本能否代表原组织的情况 直径 0 6mm 的组织样本并不能完全反应整个组织的情况 但通过在同一组织中 不同部位多次取样可以降低误差 TMA 技术是一种总体水平上的研究工具 而并不用于个体的研究 已经有很多 paper 直接比较了 TMA 技术与常规切片技术 这两种方法的一致性 达到 90 第五章第五章 生物芯片的检测生物芯片的检测 什么是生物芯片的检测 通过构建一些特殊的检测装置将标记信号转化成可供分析处理的图像数据 以便 分析在生物芯片上的生化反应 生物芯片检测的目的是什么 生物芯片检测的目的是将不可见的生物分子的微弱变化通过生物 化学 光学 电子和软件等多学科交叉技术的综合处理 转换成可见的数字图像信号 实现信 号的放大 增强和可视化 以便进行科学研究 生物芯片的检测系统是什么 生物芯片扫描仪 硬件系统与软件系统 荧光 荧光 是从一种被激发光照射的荧光团发射出来的 常见的荧光的发射波长总是比激发波长要长 每种染料都有一个荧光光谱与激发光谱 在荧光分析中 可利用激发光谱选择灵敏的激发光波长 利用发射光谱选择灵敏 的检测波长 斯托克斯位移 Stokes shift 激发峰与发射峰之间的波长差 应用 选择斯托克斯位移较大的荧光染料 例如 Cy3 550nm 570nm 20nm Cy5 649nm 670nm 21nm 二 生物芯片扫描仪的主要组成部分 激发光 发射光收集 空间定位 激发光与发射光识别 荧光探测器 三 生物芯片扫描仪检测原理 扫描仪的分类扫描仪的分类 根据探测器不同 PMT 扫描仪 CCD 扫描仪 生物芯片相对与激光器及探测器是否移动来进行扫读 扫描检测 激光共聚焦扫描仪 固定检测 CCD 芯片扫描仪 芯片检测中存在的几个问题 洁净的工作环境 5 扫描过程一定要平稳 扫描检测要及时 片子避免多次重复扫描 四 有关检测系统的重要参数及扫描过程四 有关检测系统的重要参数及扫描过程 信噪比信噪比 得到真是荧光信号的一个重要参数 表示方法 信号 噪声 两类噪声两类噪声 暗电流噪声 没有光输入时产生的噪声 来源于器件的背景噪声 发射噪声 光输入过程中产生的噪声 来源于光的粒子性所产生的背景噪声 光漂白 光漂白 Photobleaching 指荧光染料分子在激发光的照射下 其产生荧光的强度随着时间的延长逐渐变弱 消失的过程 与光漂白有关的因素 照射光的强度 照射时间 其他因素 灵敏度灵敏度 指扫描仪测定最微弱荧光的能力 通常用 um2 能测定的荧光分子数来表示 为什么要调节仪器的灵敏度 样品的准备阶段 同种染料的不同类型与批次的影响 样本本身的影响 不同样本之间的荧光强度变化 同一样本内部 不同基因表达 丰度差异 如果扫描仪的灵敏度范围设置不当 可能出现的情况 扫描强度太弱 扫描强度太强 像素与分辨率像素与分辨率 像素 构成图像的最小单元 分辨率 单位面积内容纳的像素的数目 像素的大小决定了分辨率的高低 像素越大 分辨率越高 分辨率越高则图像越 清晰 定量的准确度就越高 可以提供更精细的具有统计意义的数据 扫描过程扫描过程 将杂交 洗脱后的芯片放置于载片台上 设置扫描参数 粗扫矩阵区域 调整扫描参数和扫描区域 进行精确扫描 获得图谱 软件分析 五 生物芯片图像处理五 生物芯片图像处理 芯片图像处理的目的 得到芯片上点的强度 并在这些强度的基础上量化基因的表达水平 评估每个点的质量 并对芯片的整个工作过程可能出现的问题提出预警 一句话 芯片处理的目的是得到芯片上样点的具体信息 一 芯片图像的性质 理想芯片图像的性质理想芯片图像的性质 子块的大小相同 子块间的距离相同 所有点的形状是圆形 并且大小相同 所有点之间的距离相同 片子上没有灰尘或其他污染 图像背景均一而且值很小 理想情况芯片图像的处理理想情况芯片图像的处理 将设定大小 距离和一定个数的圆放到图像上 落在圆内的像素是信号 落在圆 外的是背景 实际芯片图像的性质 信号点位置偏移 点大小与形状不规则 有污染 其他一些全局性因素 二 芯片图像的处理二 芯片图像的处理 样点的识别与位置的确定 划格 图像信号与背景的分割 分割 信号值与背景值的确定 信息提取 6 样点质量评估与结果校正 质量评估 三 常用的芯片图像处理软件 导入图像 选定拟分析的区域 输入矩阵的行 列及矩阵个数 生成网格 调整网格 图像分割 计算信号强度 数据分析 第六章第六章 与生物芯片相关的生物信息学与生物芯片相关的生物信息学 生物信息学与生物芯片 主要体现在三个方面 主要体现在三个方面 确定芯片检测目标 提取什么信息 芯片设计 如何提取信息 实验数据管理与分析 如何处理与利用信息 基因芯片设计主要包括两个方面基因芯片设计主要包括两个方面 探针的设计 如何选择芯片上的探针 探针在芯片上的布局 如何将探针排布在芯片上 基因芯片设计的原则 基因芯片设计的原则 重复性 互补性 敏感性与特异性 可控性 可读性 三 实验数据管理与处理方法 数据存储与标准化 数据的预处理 数据的归一化 数据存储与标准化数据存储与标准化 目的 意义目的 意义 数据海量 复杂 便于数据查询与分析 便于不同试验之间的数据比较 存储的方法 存储的方法 计算机存储信息的基本方式 文件系统与数据库系统 标准化的存储格式标准化的存储格式 正在发展中 基因芯片发展年限短 数据复杂 芯片生产平台 处理软件各异 微阵列基因表达谱数据组织 MGED 提出了芯片实验室最低限度信息标准 minimum information about a microarray experiment MIAME 数据的预处理 数据的预处理 背景的校正 弱信号的处理 数据的对数转换 重复数据的合并 数据的归一化 第七章第七章 微流路芯片微流路芯片 微流路芯片 以分析化学和分析生物化学为基础 以微机电加工技术为依托 以微管道 网络为结构特征 把整个化验室的功能 包括采样 稀释 加试剂 反应 分离 检测等集成在微芯片上 微流控芯片实验室的基本特征和最大优势 微流控芯片实验室的基本特征和最大优势 多种单元技术在微小平台上的灵活组 合和规模集成 微流控芯片与微阵列芯片有显著的不同 它主要依托分析化学和生物学 芯片的 构造为微管道网络结构 通过微管道中的流体控制来实现分离和分析的目的 一 张芯片可重复使用数十至数千次 而微阵列芯片主要依托生物学 通过生物分子 之间的杂交实现检测的目的 一张芯片一般只使用一次 微流路芯片的分析操作微流路芯片的分析操作 样品制备样品制备 1 超声处理 2 提取 微透析法 液液提取法 固相提取法 3 预浓缩 进样 进样 先把样品导入到芯片上 然后再采用电动或电渗的方法注射到分离通道中