不同基因型沙眼衣原体小鼠生殖道感染中CPAF、IFNγ和IL10的表达.doc

不同基因型沙眼衣原体小鼠生殖道感染中CPAF、IFN和IL10的表达 廛丛些痘趁痘堂壅查圣Q12生!旦箜兰!鲞箜兰塑199【引文格式】王柳苑，赵培祯，薛耀华，等不同基因型沙眼衣原体小鼠生殖道感染中cPAF、IFN1和IL10的表达J皮肤性病诊疗学杂志，2019，26 (4)199203DOI103969jissn16748468201904001不同基因型沙眼衣原体小鼠生殖道感染中CPAF、IFN一7和IL一1O的表达王柳苑，赵培祯，薛耀华，杨立刚，郑和平，杨斌(南方医科大学皮肤病医院，广东广州510091)摘要目的建立不同基因型沙眼衣原体小鼠生殖道感染模型，分析cPAF、IFN叫和IL10在不同基因型沙眼衣原体小鼠生殖道感染中表达的差异。 方法将70只雌性Balbc小鼠随机分为E组、F组、J组、K组、H组、空白对照组及实验对照组，阴道内分别接种30山E、F、J、K、H型沙眼衣原体，空白对照组不做处理，实验对照组阴道接种30斗L SPG。 ELISA法检测感染后第35d子宫输卵管组织匀浆中cPAF、IFN1和IL10的表达，并进行统计比较。 结果接种CT后35dH组子宫输卵管组织匀浆CPAF浓度明显高于E组、F组、J组(P值均005)，K组cPAF浓度明显高于F组(P005)；H组和K组子宫输卵管组织匀浆IFN一1和IL一10浓度均明显高于E组、F组、J组(P值均005)。 结论不同型别cT感染小鼠后，上生殖道组织中cPAF、IFN叮和IL10呈明显差异表达，提示不同基因型cT泌尿生殖道感染可能产生不同的临床结局。 关键词沙眼衣原体；CPAF；IFN-叫；IL一10；小鼠R759ADOI103969jissn16748468201904001论著Expression of CPAF，1N-Y andIL-10in di仃erent genotypesof仍肠哪讹棚c庇Dm口巍iso1ated frOmmice genitalinfection删B三iu-yun凡，Z删0Pei一如en，X晒y0D-矗M口，M忙乜一gn愕，删G m-pi昭，蹦G日流(De肌oofogy舶印删，sou如m讹dic口f如e瑙妙，GM口n鼬础510091，吼；no)CDr陀印ond伽g ouhor，AG B汛，E-mo以弘n96流101hDmo识cDmAbstractobjectiveTo analyzedi珏brences inexpressions of cPAF，IFN-一y andIL-10by es-tablishing mousegenital tractinfectionwith differentCT genotypesMethodsSeventy femaleBalbc micewere mndomlydivided intoE group，F group，J group，K铲oup，H group，blankcontrol groupand experimentalcontrol gmupC危f口州如trocom口函genotypes E，F，J，K and H(30“L)were inoculatedinto vaginarespectivelyThe blankcontrol groupwas nottreated，whilethe experimentalcontrol groupwas inoeulatedinto Vaginawith30斗L SPGExpression of CPAF，IFN-一y andIL-10in theutems andf甜lopian tubewas detectedby ELISAon day35postinoculationR鹪ultsOn day35post-inoculation，the eoncentrationof CPAFin homogenateof utemsandfallopian tubein groupH wassignificandy higher than that in group E，F andJ(aU P CT感染在临床上多呈隐匿发展，可出现轻微症状或无症状，女性生殖道感染后可引起宫颈炎及子宫内膜炎，进而上行感染至输卵管，引起输卵管炎、输卵管积水、盆腔炎，导致不孕不育、异位妊娠等并发症。 2。 4o。 患者之间出现临床症状的差异，是与不同基因型CT致病性的差异有关，还是宿主个体差异的原因所致尚未完全清楚。 因此，探讨不同基因型CT致病性的差异及其可能的发病机制，对cT感染的防治及控制传播有着重要意义。 我们前期动物模型研究o发现，不同cT基因型别致病性间存在一定差异，且不同感染时期表现不同E、F型CT主要引起宫颈黏液脓性分泌物，上行感染不明显J、K、H型CT感染早期症状不明显，但容易出现上行感染并导致严重的子宫输卵管病变。 产生上述差异的具体发病机制尚不清楚。 众所周知，CT的上行感染及其感染后所诱导的局部炎症反应是引发输卵管炎症的必要条件。 67o。 为了克服宿主的免疫清除反应，形成持续性感染，cT会产生并利用某些毒力因子促进其感染进程旧J，对抗宿主的免疫反应，其中最为重要的是衣原体蛋白酶样激活因子(chlamydial pr0_tease-like activityfactor，CPAF)。 研究表明在cT感染过程中，cPAF能够通过调控各种宿主信号转导通路辅助CT逃避宿主免疫清除反应一。 12。 ，进而维持CT的持续性感染。 炎症因子IFN一1是引起输卵管免疫损伤发病机制中最重要的细胞因子，而IL10的过度分泌可能引起持续性感染和组织不可逆性损伤。 因此，本研究建立不同基因型CT生殖道感染模型，拟通过探讨不同基因型CT生殖道感染组织中CPAF及炎症因子IFN一 1、IL一10表达的差异，来阐明不同基因型CT致病性之间的差异及其可能的发病机制。 1材料与方法11实验动物和试剂111实验对象将70只67周龄雌性Balbc小鼠随机分为E组、F组、J组、K组、H组、空白对照组及实验对照组，共7组，每组10只。 体质量1720g，每只动物作标记，在暨南大学动物实验中心动物房分笼颗粒饲料饲养。 112细胞株McCoy细胞购买于美国Bivd大学AT，本实验室保存传代。 实验菌株E、F、J、K、H型CT菌株，为本实验室培养保存的临床野生株。 113试剂和仪器组织裂解液(潮州凯普生物化学有限公司)，CPAF、IFN一1和ILlO ELISA试剂盒(美国RB公司)。 漩涡混匀器(上海沪西分析仪器厂有限公司)，培养瓶、冻存管、Eppendorf管和细胞计数板(美国FALCON公司)，洗板仪(美国BIRAD公司)，酶标仪(郑州博赛生物工程有限责任公司)。 12实验方法121细胞培养和动物模型建立E、F、J、K、H型cT株体外培养、制备感染液的方法参照文献。 4o。 建立动物模型E组、F组、J组、K组、H组于接种前10d、实验对照组小鼠于接种前3d皮下注射醋酸甲羟孕酮25mg，然后于阴道内分别接种30灿E、F、J、K、H型CT悬液(约25107IFUmL)，实验对照组阴道接种30斗L sPG，空白对照组不做任何处理。 122ELISA法检测子宫输卵管组织匀浆中cPAF、IFN一y和IL一10的表达于接种cT后第35d颈椎脱臼法处死所有小鼠，即刻完整切取子宫输卵管组织于液氮罐保存，随后研磨制成PBs组织匀浆，ELISA法检测组织匀浆中CPAF、IFN吖和IL一10的表达，操作严格按照试剂盒说明书进行。 万方数据13统计学处理采用SPSS20O进行数据分析，各组间CPAF、IFN一y和IL-10表达水平采用均数标准差进行描述，多组间比较采用方差分析，对于方差分析有意义的指标均进一步采用Bonferroni法进行两两比较，P ，)轱垦厶当日术21各组间子宫输卵管组织匀浆中CPAF表达水平各组间子宫输卵管组织匀浆中CPAF表达水平差异有统计学意义(F=9436，P005)。 各组间两两比较发现，E组、F组、J组、K组和H组小鼠子宫输卵管匀浆中CPAF水平均高于空白对照组及实验对照组(P值均O05)；K组CPAF浓度明显高于F组(PO05)。 详见表 1、图1。 22各组间子宫输卵管组织匀浆中IFN一吖表达水平各组间子宫输卵管组织匀浆中IFN一y表达水平差异有统计学意义(F=3927，P005)。 各组间两两比较发现，E组、F组、J组、K组和H组小鼠子宫输卵管匀浆中IFN一y水平均高于空白对照组及实验对照组(P值均005)。 详见表 1、图2。 23各组间子宫输卵管组织匀浆中IL一10表达水平各组间子宫输卵管组织匀浆中IL-10表达水平差异有统计学意义(F=8820，P 各组间两两比较发现，E组、F组、J组、K组和H组小鼠子宫输卵管匀浆中ILlo水平均高于空白对照组及实验对照组(P值均005)。 详见表 1、图3。 表1各组问子宫输卵管匀浆中cPAF、IFN一y和IL10表达水平(贾s)Tab1Expression leVelsofCPAF，IFNY andIL10in theuteI1ls andfh儿opiantubeamong groups(js)组另0cPAF(pmoLL)IFN-1(ngL)ILlO(pgmL)E组F组J组K组H组实验对照组空白对照组64439士868565020815646508223459777632469170977649686355264123354969076851947950335471569106858433012130(1156450士4488795084587 (1)87707士778(”60783士2502(31600190253745lO56386581117301852165469622525375081136注 (1)表示与E组、F组和J组比较，P E组F组J组K组H组实验空日组别对照组对照组a与E、F、J组比较，P P T细胞介导的免疫反应在CT感染的发病过程中发挥着重要作用。 n1免疫应答能增强宿主对抗病毒和细胞内病原体感染，而r1112免疫应答则与感染的进展、持续性和慢性化有关，对微生物感染有负调节作用。 目前研究表明，宿主抗CT感染以Thl细胞及其细胞因子(如IFNIL12)介导的反应和黏膜分泌的免疫球蛋白抗体为主，而T12细胞及其细胞因子(如IL石、IL10)主要参与炎症反应3141。 其中，IFN一1是引起输卵管免疫损伤发病机制中最重要的细胞因子。 研究表明，IFN一1能诱导巨噬细胞分泌诱导型一氧化氮合成酶，水解L-精氨酸产生一氧化氮，从而抑制CT的生长5|，并激发宿主免疫反应引起局部组织损伤。 IFN-1作用于抗原递呈细胞，提高将抗原呈递给局部T细胞的效率，放大迟发型超敏反应，促使其他细胞因子如IL 1、TNF一0【等产生，共同发挥细胞毒性作用，参与局部组织损伤及瘢痕形成。 IL-lO是一类负调控炎症细胞因子，IL-10的过度分泌可能引起持续性感染和组织不可逆性损伤。 本研究发现，不同基因型CT感染小鼠后，各组小鼠上生殖道组织中均高表达IFN-1和IL-10，H型和K型CT感染组子宫输卵管组织中IFN-1和IL-10浓度明显高于E、F、J型CT感染组，表明H型和K型CT感染小鼠后诱发的炎症反应更重。 这与我们前期研究结果相符合，在小鼠感染CT后期，H型和K型CT感染组小鼠出现严重的子宫肿胀、增粗并积脓积液，输卵管扩张积水、纤维组织增生、管腔变窄，而E、F型CT感染组小鼠子宫输卵管上述改变不明显5|。 CT初始感染部位在宫颈，然而由其引发的盆腔炎、输卵管炎、输卵管积水所致不孕症及异位妊娠却发生在上生殖道的输卵管中心J。 这表明CT拥有完整的对抗机体免疫反应的机制，以克服宿主生殖道黏膜上皮的免疫监视和免疫反应上行感染，进而在上生殖道形成持续性感染。 炎症因子如IFN一y和IL10介导T细胞免疫反应可快速清除CT。 CT在宿主上皮细胞内大量增殖导致上皮细胞破裂后，大量的CT蛋白因子伴随着CT同时释放到组织间隙，并被宿主免疫系统识别，引发快速免疫反应，尤其是T细胞免疫反应，以清除感染的cT?j。 必须及时酶解CT免疫抗原才能有效逃避宿主T细胞的免疫识别，CPAF在此过程中及时有效地发挥着重要作用。 研究表明，CPAF能通过降解转录因子RFX5和USF1，抑制IFN-1诱导的MHC分子的表达一。 10I，并通过酶切降解CT T细胞抗原和直接酶切O他来抑制MHC抗原递呈过程，从而逃避宿主免疫系统对CT的识别及免疫攻击。 本研究发现，接种CT后35d，H和K型CT感染组小鼠子宫输卵管匀浆中cPAF水平明显高于F型CT感染组。 表明H型和K型CT感染小鼠后可能更容易通过上述机制逃避宿主生殖道黏膜上皮的免疫监视和免疫反应，进而上行感染引发持续性免疫损伤，导致严重的子宫肿胀增粗并积脓积液、输卵管扩张积水、纤维组织增生、管腔变窄。 推测不同基因型CT泌尿生殖道感染可能产生不同的临床结局，提示在临床诊疗过程中可对患者进行CT基因分型检测，以便进一步指导cT感染的治疗及预防并发症的发生。 参考文献1LEON sR，sEGuRA ER，KONDA KA，et a1Highprevalence ofC缸m廊trneJ幻mm蠡andeisser施gD胼小oe伽infections in柚al andpharyngeal sites姗g amunity-based s砌ple ofmen whohave sexwith menandtransgender w锄en inLjma，PemJBMJ0pen，xx，6 (1)e0082452BuDRYs NM，GONG S，RODGERS AK，et a1万方数据345678CZ凸myd尬rocom口胁antigens recognizedin women埘lhtubal factorinfertility，normal fertility，and acuteinfec-tionJ0bstet Gynecol，xx，119 (5)10091016HAFNER LM，TIMMS PDevelopment ofa Chfo，r砂di口rocomot曲vaine forumgenital infectionsnovel toolsandnew strate百es pointto brightfuture prospectsJExpen RevVainess，2018，17 (1)57_69WITKIN SS，MINIS E，ATHANASl0U A，et a11吼fonl徊in打uc矗D，rnf如the PersistentPathogenJclinVaine Immun01，xx，24 (10)piie00203-17王柳苑，郑和平，薛耀华，等不同基因型沙眼衣原体致小鼠生殖道感染的病理研究J皮肤性病诊疗学杂志，xx，20 (2)80-84LEI L，CHEN J，HOU S，et a1Reduced liveorganismrecovery andlack ofhydmsalpinx inmice infectedwithplasmid-fbe Ch胁m记m“d口mmJInfect Im舢n，xx，82 (3)983-992ZHANG H，ZHOU Z，CHEN J，et a1Lack oflong-last-ing hydmsalpinxin AJ micecorrelates withrapid but协ansient chlamydialascension andneutrophil recruitmentinthe oviductfoUowingintrava西nalinoculation with(流20玎幻，d施murid口r“mJInfect Immun，xx，82 (7)26882696BYRNE GIC危如，n徊i口froc，m，rLo括stmins andVim-lencerethinking1inksto infectionpreValence anddis-ease severityJJ I山ct Dis，xx，201(suppl2)S126S133ZHONG G，FAN T，UU LC矗fnm，垅o inhibitsinterfer-203ongamma-inducible majorhistopatibility plexclassexpression bydegradation ofupstream stimulatory factor1JJ ExpMed，1999，189 (12)1931-1938ZHONG G，LIU L，FAN T，et a1Degradation oftran-scription factorRFX5during theinhibition ofboth constitutive andinterferon gamma-inducible majorhistopatibility plexclass Iexpression info，州；。 -infectedcellsJJ ExpMed，2000，19l (9)15251534ROAR NRSTARNBACH MNImmune-mediated con-tml of吼fo，州葩infectionJceu Micmbiol，xx，10 (1)919PATTON MJ，CHEN CY，YANG C，et a1Plasmid neg-ative regulationofCPAFexpression isPgp4independentand restrictedto invasiveCfo，圳inrocb，船括biovarsJMBio，2018，9 (1)piie02164-17ARMITAGE CW，0MEARA CP，HARVIE MC，eta1Evaluation ofintm-and extra-epithelial secretor)，IgAin chlamydialinfectionsJImmunology，xx，143 (4)520-530MABEY DC，HU V，BAILEY RL，et a1Towards asafeand