DNS法测定还原糖的含量

DNS法测定还原糖的含量 Chemistry Chemistry 3 5 二硝基水杨酸溶液与还原糖溶液共热后被还原成棕红色的氨基化合物 在一定范实验围内反应的还原糖的量和棕红色物质颜色深浅的程度成一定比例关系 可测定生成化合物的吸光度 由标准曲线反推出还原糖的浓度 操作简便 快速 杂质干扰较少 适于生物制氢中还原糖含量的测定 实验原理 Chemistry 显色条件包括 波长选择 显色剂用量 显色时间 溶液酸度 显色温度 有机络合物的稳定性及共存离子的干扰等 此次实验选择波长选择 显色剂用量 显色时间 溶液酸度进行实验 一 试剂的配置DNS试剂 称量18 1992g酒石酸钾钠溶于50ml蒸馏水中 加热 趁热加入0 6313g3 5 二硝基水杨酸 DNS 另配制2mol lNaOH溶液 取26 2ml加入上述溶液中 称量0 5128g苯酚和0 5064g无水亚硫酸钠移入配置好的溶液中 蒸馏水定容至100ml 该试剂避光保存7 10天 葡萄糖标准溶液 1 0 10 2mol l 准确称量0 1990g无水葡萄糖 待溶解后定容至100ml容量瓶中 葡萄糖标准溶液 1 0 10 3mol l 取10ml上述10 2mol l溶液 稀释至100ml容量瓶中 葡萄糖标准溶液 1 0 10 4mol l 取10ml上述10 3mol l溶液 稀释至100ml容量瓶中 二 显色条件的选择1 波长选择取5支试管按下表加相应溶液 沸水浴15min 均加入7ml水定容为10ml 流水冷却 在不同波长处分别进行扫描 图1为不同条件下溶液的波长 吸光度图 水调零 由图1可以看出白色与绿色曲线几乎重合 说明0 0001mol l葡萄糖溶液与DNS反应生成的氨基化合物极少 用比色法很难区分 故此法所能够测量的葡萄糖浓度应大于0 0001mol l 由DNS H2O曲线可以看出当波长大于530nm时 DNS的吸光度已经很小 这时DNS对反应生成的氨基化合物吸光度的影响可以忽略 Fig 24号试管稀释10倍后波长扫描 吸光度A nm 图2为4号试管稀释10倍后波长扫描图4号试管用高浓度的葡萄糖溶液和少量的DNS试剂反应 使生成大量的氨基化合物 但其吸光度太大 仪器无法测定 故将其稀释10倍 以水调零未出现最高峰 以DNS调零时 图2 在540nm处有最高峰 这说明在该浓度下 DNS可能会对氨基化合物吸光度的测量有较大影响 故测量时以DNS调零较准确 选择540nm作为最佳吸收波长 2 DNS用量选择取试管按下表加相应溶液 沸水浴30min 加入适量水使定容为10ml 流水冷却 以1号试管中DNS溶液为参比 在540nm处测吸光度 由图3可以看出溶液的吸光度随着DNS用量的增大而增大 但当DNS用量达到3 5ml时 吸光度反而下降 这说明DNS的用量不是越多越好 只要在与糖的反应中DNS有剩余即可 如果DNS用量过多 会使测量时DNS溶液浓度过大 造成测量不准 综合考虑 此次实验选定的DNS用量为2ml 3 反应时间 水浴时间 取试管按下表加相应溶液 沸水浴相应时间后 加入7ml水定容为10ml 流水冷却 以6号试管中的DNS试剂调零 在540nm处测吸光度 由图4可以看出 随着煮沸时间的加长 吸光度加大 另有实验表明单纯加热DNS试剂也会使其吸光度增大 故在制作标准曲线和测定未知浓度时 煮沸时间必须相同 此次实验确定最佳煮沸时间为30min 4反应溶液的酸度范围的选择取试管按下表加相应试剂 由于所用器皿为试管 不方便用PH计调节PH 此次实验采用加入不同量的6 的盐酸溶液的办法 以PH试纸调节溶液的酸度 煮沸20min后 各加入7ml水定容为10ml 流水冷却 以DNS试剂调零 在540nm处测吸光度 图5中的PH是用PH试纸调出的 该曲线只能反映变化趋势 由图5可以看出 溶液的碱性越强 反应进行的越完全 溶液的酸度越小 越有利于氨基化合物的生成 另外由于DNS试剂就是用NaOH溶液配制的 单纯DNS与水的混合液的PH值已经超过14 且DNS在反应中是过量的 反应时间是足够长的 故测量时只需将被测溶液调至中性 无需刻意调节反应混合物溶液的PH值 保证测量时DNS试剂 糖的用量与制作标准曲线时相同即可 三 标准曲线的建立取试管按下表加相应试剂 由0 01mol l葡萄糖标准液配制x 10 4mol l 3 x 27 的葡萄糖 煮沸30min后 各加入7ml水定容为10ml 流水冷却 以DNS试剂调零 在540nm处测吸光度 下图1为葡萄糖标准曲线图 葡萄糖含量 mol l 与相应的吸光度 A 有一定的线性关系 且其回归方程为 y 0 14971 0 035786x R 0 9954 另外采用较高浓度的葡萄糖来制作标准曲线 得到下图2 其回归方程为 y 0 10483 0 031804x R 0 99817 当所测得的吸光度比较小时 可用