核酸的分离与纯化

核酸的分离与纯化 Chapter2 Chaptor2核酸的分离与纯化 就基因工程而言 核酸分子是其研究所涉及的主要对象 所以核酸的分离与提取是研究中很重要的基本技术 核酸样品的质量将直接关系到实验的成败 核酸的分类 DNA主要存在于细胞核的染色体中 核外也有少量DNA 如线粒体DNA mtDNA 叶绿体DNA cpDNA 质粒DNA RNA存在于细胞质中 如mRNA rRNA tRNA等 除上述DNA RNA外 还有非细胞形式存在的病毒和噬菌体 其或只含DNA 或只含有RNA 核酸制备的一般原则 分离纯化核酸总的原则 应保证核酸一级结构的完整性 排除其它分子的污染 核酸纯化应达到的要求 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子 其它生物大分子的污染应降低到最低程度 排除其它核酸分子的污染 核酸制备的一般原则 核酸制备时应注意的事项 尽量简化操作步骤 缩短提取过程 减少化学因素对核酸的降解 PH4 10 减少物理因素对核酸的降解 机械剪切力和高温 防止核酸的生物降解 核酸制备的一般原则 核酸制备的步骤 破碎细胞 提取 纯化 核酸制备的一般方法和原理 核酸酶的抑制和抑制剂剂降低温度 改变pH及盐的浓度 都利于对核酸酶活性的抑制 但均不如利用核酸酶抑制剂更有利 当然 几个条件并用更好 对于DNA 抑制DNase活力很容易 但防止机械张力拉断则更重要 对于RNA 因分子较小 不易被机械张力拉断 但抑制RNase活力较难 故在RNA提取中设法抑制RNase更重要 核酸制备的一般方法和原理 核酸酶的抑制和抑制剂剂DNase抑制 加入少量金属离子螯合剂 如0 01EDTAmol L或柠檬酸钠 DNase基本可以全部失活 去垢剂 蛋白变性剂及DNase抑制剂也可使DNase失活 核酸制备的一般方法和原理 核酸酶的抑制和抑制剂剂RNase抑制 操作要带手套 所有器皿要严格消毒 试剂处理 低温操作 在分离过程中要加入一定的RNase抑制剂 核酸制备的一般方法和原理 核酸制备中常用的去垢剂核酸本身带负电荷 结合带正电荷的蛋白质 用于核酸提取的去垢剂 一般都是阴离子去垢剂 去垢剂的作用 1 溶解膜蛋白及脂肪 使细胞膜破裂 2 溶解核糖体上面的蛋白质 使其解聚 将核酸释放出来 3 对RNase DNase有一定的抑制作用 核酸制备的一般方法和原理 核酸制备中常用的去垢剂SDS脱氧胆酸钠4 氨基水杨酸钠萘 1 5 二磺酸钠三异丙基萘磺酸钠 核酸制备的一般方法和原理 核酸制备中常用的蛋白质变性剂蛋白质变性剂的作用 1 使蛋白质变性 沉淀 从核酸提取液中分离除去 以防造成蛋白污染 2 使蛋白质变性 故可使核糖体解聚释放出核酸 3 某些蛋白质变性剂也有抑制RNase活性和破裂细胞的作用 核酸制备的一般方法和原理 核酸制备中常用的蛋白质变性剂苯酚氯仿盐酸胍DEPC 核酸制备的一般方法和原理 核酸制备中常用的酶制剂DNaseRNase蛋白酶K溶菌酶 核酸制备的一般方法和原理 核酸提取的一般过程破碎细胞 防止核酸酶的作用 微生物 溶菌酶 SDS裂解 高等植物 捣碎器破碎 液氮研磨 酶法 蛋白酶 如胰蛋白酶 冰冻法 反复冻融或液氮冻后组织捣碎 动物 液氮处理后用匀浆器破碎 细胞器DNA 首先纯化细胞器 以上处理时均要同时加入核酸酶抑制剂 核酸制备的一般方法和原理 核酸提取的一般过程破碎抽提核酸除去杂质1 首先使脱氧核糖核蛋白 核糖体 病毒的核蛋白与其它成分分离2 使核酸与蛋白质分离3 除去脂类4 多糖的除去 核酸制备的一般方法和原理 核酸提取的一般过程核酸的纯化根据所需核酸的性质和特点除去其它核酸污染 并除去提取过程中的系列试剂 盐 有机溶剂等 杂质 最后得到均一的核酸样品 核酸样品的保存 核酸保存的主要条件是温度和介质温度 4 5 最佳和最简单 70 是长