IL10RA基因多态性与儿童幽门螺旋杆菌感染关系的初步探讨.doc

IL10RA基因多态性与儿童幽门螺旋杆菌感染关系的初步探讨 徐州医科大学学报J XuzhouMed Univ2018，38 (6)403IL一10RA基因多态性与儿童幽门螺旋杆菌感染关系的初步探讨陆田田r，肖欢庆，王春莉，郑必霞。 ，练敏，金玉，刘志峰(1南京大学医学院，江苏南京210008；2南京鼓楼医院集团宿迁市人民医院儿科，江苏宿迁223800；3南京医科大学附属儿童医院消化科，江苏南京210008)摘要目的探讨白细胞介素10受体(IL一10R)基因多态性与儿童幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori，Hp)感染的相关性。 方法262例因消化道症状而行”C呼气试验(”Curea breathtest，”CUBT)患儿，依据Hp检测结果分为Hp感染组和对照组，并留取患儿唾液标本，提取样本DNA，应用PCR及Sanger基因测序方法筛查IL一10R的多态性基因及分布情况。 结果本实验共筛查IL一10RA的5个基因多态性位点rs 4252249、rs 2228054、 2256111、rs2228055及rs2229113。 第四外显子的基因多态性位点rs 2256111、rs2228054的AA、AG、GG三种基因型，经统计学分析，GG基因型在组间差异具有统计学意义(P005)；等位基因G在感染组和对照组间差异具有统计学意义(P005)。 结论提示IL一10RA第四外显子的基因多态性位点rs 2256111、rs2228054的GG基因型及等位基因G可能与Hp感染相关。 关键词幽门螺旋杆菌；儿童；白细胞介素10；白细胞介素10受体；基因多态性R7257文献标志码A20963882 (2018)06040305A preliminary studyon therelationship betweenIL-IORA gene polym orphismand HeEcobacter pyloriinfection inchildren LUTiantian，XIAO Huanqing，W ANGChunli，ZHENG Bixia，LIAN Min。 ，JIN Yu，LIU Zhing3(1Medical School，Nanjing University，Nanjing，Jiangsu210008，China；2Department ofPediatr ics，Suqian PeopleS Hospital，Nanjing GulouHospital Group，Suqian，Jiangsu223800；3Department ofGastroenterology，ChildrenS HospitalA filiated toNanjing MedicalUniversity，Nanjing，Jiangsu210008)AbstractObjective Toinvestigate thecorrelation betweeninterleukin一10receptor A(IL一10RA)genepolymorphism and Helicobacter pylori(Hp)infection inchildrenMethods Atotal of262patients withgastrointestinal symptomsunderwent“Curea breathtestAording tothe testresultsthe patientswere dividedinto anHp infection group anda controlgroupIn addition，saliva sampleswere takento extractsamples ofDNA，and thepolymorphie genesand distribution of IL一10RA werescreened byPCR anddirect sequencingResults Inthis study，5gene polymorphisms ofILIORA werescreened out，namely rs4252249，rs2228054，2256111，rs2228055and rs2229113The geic polymorphismsof thefour thexon werefnund inrs2256111and rs2228054with GenotypesAAAG andGGStatistical differenceswere foundin GG genotype betweenthe groups(P005)The differenceof theallele Gin thein fectiongroup and the controlgroup wasstatistically significant(尸05)，具有可比性。 本研究经医院伦理委员会批准，均征得儿童监护人知情并自愿签署书面知情同意书。 排除标准有Hp感染根除史，2周内服用质子泵抑制剂类及H，受体拮抗剂类药物，1个月内服用过抗生素类的儿童。 12主要仪器和材料”CUBT试剂盒(北京勃然制药有限公司)；”C呼气红外光谱分析仪(广州华友明康光电科技有限公司)；1L一10RA引物(擎科新业生物技术有限公司南京合成部)；唾液DNA提取试剂盒，PCR试剂2Taq PCRMaster Mix(天根生化科技公司)。 13方法131诊断方法受检前应在早晨空腹或禁食2h以上，告知儿童相关注意事项，维持正常呼气，向气袋吹气至气袋饱满，立即扭紧气袋盖，标记为0min呼气。 受检者用80100ml凉饮用水送服尿素颗粒，静坐。 同样方法收集30min呼气样品，在相应的仪器上检测前后气体中C原子标记的二氧化碳的丰度(8)，检测DOB(deltaoverbaseline)=8。 (30min)一8v(0min)，计算DOB值I40时，考虑Hp阳性，初步判定受试者为Hp感染。 132唾液标本DNA提取患儿空腹时留取唾液2ml，立即分装于收集管、编号，一80。 冰箱保存，以备提取DNA。 严格按照唾液DNA试剂盒步骤提取，使用One Drop分光光度计检测DNA浓度及纯度(所有收集唾液样本均成功提取DNA)。 133引物设计及PCR产物扩增根据NCBI基因库NT一009151中IL一10RA基因序列，应用Premier50软件设计7对引物(表1)，要求能覆盖7个外显子及侧翼内含子序列。 抽取30例DNA样本于T100Thermal CyclerPCR扩增仪进行PCR扩增，总反应体系2512Taq PCRMaster Mix125l，焦碳酸二乙酯(DEPC)水95txl，上下游引物各1l，模板DNA11。 反应条件为95qc预变性5r ain，95变性30s，60退火30s，72延伸40s，共35个循环，最后72再延伸5min。 所得PCR产物于1琼脂糖电泳鉴定后送至南京擎科新业生物技术有限公司进行Sanger测序。 134PCR产物分析将测序序列使用Chromas Lite软件查看，通过Blast与GenBank数据库标准序列进行比对找出可疑IL一10RA基因SNP位点，筛选出目标SNP进行批量测序。 14统计学处理采用SPSS25进行统计分析，计算不同基因型分别在感染组及对照组中的分布频率，组间率的比较采用x检验。 P005为差异有统计学意义。 2结果21IL一10RA外显子多态性初筛结果30例初筛样本的7个外显子基因序列通过Blast对比分析，筛查出IL一10RA的5个SNP位点，分别是第二外显子rs4252249，第四外显子rs 2228054、rs2256111，第五外显子rs2228055及第七外显子rs2229113。 各等位基因位点的分布频率分别为A=0056，G=057，A=030，G=026，G=1。 其中第二外显子rs4252249的等位基因分布频率为0056，等位基因分布频率越低，可信度越低，样本量需求越大_6J，因此我们只选取基因分布频率大于01的SNP位点进一步筛查。 而第七外显子只筛选出1种基因型GG，这与1000Genomes数据库中的中国汉族人群基因分布一致。 根据初筛结果，我们选择第四外显子rs 2228054、rs2256111，第五外显子rs2228055进行批量测序。 在IL一10RA rs 2228054、rs 2256111、rs2228055每个位点发现3种等位基因组合，即AA、GG、AG(图13)。 各SNP位点的等位基因、基因徐州医科大学学报J XuzhouMed Univ2018，38 (6)型在对照组的分布符合HardyWeinberg平衡，具有群体代表性。 表1ILIORA外显子引物序列G6t G。 6c-，c t c c。 c。 l翻c-Tcc图1EXON4rs2256111基因型AA、GG、AG瑚图2EXON4rs2228054基因型AA、GG、AG GG TG c誓c24tc c cT cO图3EXON5r82228055基因型AA、GG、AG m埔J l瑚Itc cll I-5。 G-5GT ec-T cj cT cI0ml。 C C0I406徐州医科大学学报J XuzhouMed Univ2018，38 (6)22IL一10RA SNP位点rs 2228054、rs 2256111、rs2228055与Hp感染相关性分析测序样本中共完成122例Hp感染患儿和140例未感染者IL一10RA第四及第五外显子的DNA测序。 结果显示，rs2256111位点的AA、AG、GG3种基因型，GG基因型在感染组中比例明显高于对照组，经统计学分析，GG基因型频率在2组间差异具有统计学意义(P005)；G等位基因分布频率感染组高于对照组，差异有统计学意义(P005)(表2)。 rs2228054位点的AA、AG、GG3种基因型，GG基因型、G等位基因在感染组比率高于对照组，经统计学分析后GG基因型及G等位基因频率在2组间差异具有统计学意义(P005)(表4)。 表2EXON4rs2256111各基因及基因型在Hp感染组和对照组中的分布频率例()表3EXON4rs2228054各基因及基因型在Hp感染组和对照组中的分布频率例()表4EXON5rs2228055各基因及基因型在Hp感染组和对照组中的分布频率例()。 要作用。 IL一10是由多种细胞类型分泌的抗炎细胞因子，对于维持胃肠道内的免疫平衡至关重Hp感染的致病进展主要受环境、不同人群的免要。 Aihara等研究显示Hp感染者胃黏膜中IL疫遗传及菌株毒力高低等方面因素的影响。 宿主的一10的mRNA增多，且mRNA增多程度与炎症的严免疫遗传因素和细胞因子对Hp感染的结局起着重重性呈正相关。 还有研究表明，尿素酶启动特异性TH1TH2型免疫反应，并分泌IL一10等细胞因子，徐州医科大学学报J XuzhouMed Univ2018，38 (6)407从而诱导抵抗Hp感染的保护性免疫反应。 近年研究显示，Hp可通过诱导IL一1O和抑制IL一12分泌和下调主要组织相容性复合体一(MHC一)从而诱发特异性调节性T细胞，引发树突状细胞的重组l1。 IL一10主要与其特异性受体IL一10RA结合并激活JAKSTAT通路才能发挥作用。 目前尚无关于IL一10R与Hp感染的相关性研究，为初步探讨两者相关性，我们对南京及其周边地区汉族儿童的IL一10RA基因进行分析。 本研究结果显示，第四外显子rs 2256111、rs2228054的GG纯合子型在组间差异均具有统计学意义(P005)。 等位基因AG在感染组和对照组间差异亦具有统计学意义(P005)。 提示rs 2256111、rs2228054基因型GG与等位基因G可能与Hp感染相关。 对第五外显子rs2228055感染组统计分析后，AA基因型和等位基因A的分布比例高于对照组，但统计学差异不显著。 不排除因本次研究例数偏少，导致的选择偏倚而对结论造成影响，必要时可能需要加大样本量进一步探究。 此外，本研究发现rs2256111的AA、AG、GG3种基因型分布对应rs2228054的AA、AG、GG3种基因型及rs2228055的GG、AG、AA分布具有较高的一致性，同一DNA样本rs2256111为AA，对应rs2228054为AA，rs2228055为GG的比例高达8485，3种不同SNP位点是否具有协同作用需进一步研究。 综上所述，IL一10RA的第四外显子的rs 2256111、rs2228054的等位基因C及GG基因型可能与Hp感染有关，其与Hp感染后的疾病转归的相关性以及基因调控、其信号传导有必要进一步深入研究参考文献1A1AsqahM，A1Hamoudi N，An ti S，et a1Isthe presenceofHe一234567891O12licobacter pyloriin dentalplaque ofpatients withchronic periodon-titis arisk factorfor gastr ic infection?JCan JGastroenterolxx，23 (3)177179Ruggiem PHelicobacter pyloriand inf lammationJCurr PharmDes，xx，16 (38)42254236W atanabeT，Asano N，FichtnerFeigl S，et a1NOD1contr ibutes tomouse hostdefense againstHelicobacter pylorivia inductionof typeI IFNand activationof theISGF3signaling pathwayJJ ClinInvest，xx，120 (5)16451662Sugimoto M，Yamaoka Y，Furuta TInfluence ofinterleukin polymorphisms ondevelopment of gastric cancer andpeptic ulcerJWorld JGastroenteml，xx，16 (10)11881200Zeng X，Li Y，Liu T，et a1Pylori strains，IL一10promoter poly-morphisms withhigh morbidityofgastriancerin Hexiarea ofGansu Province，ChinaJMol CellBiochemxx，362(12)241248Jorgenson E，Witte JSCoverage andpower ingenomewide association studiesJAm JHum Ge，xx，78 (5)884888Zambon CF，Basso D，Navaglia F，et a1Pmand antiinflammatory cytokinesgene polymorphismsandHelicobacter pylori infeetion Iinteractions influence outeJCytokine，xx，29 (4)141152Moo