科学前沿　授予诺贝尔化学奖的通道蛋白研究.docx

通道蛋白研究生命系统约70%由水组成，所有生物都需要水进出细胞。科学家很早就知道水分子除了能够以简单扩散的手段通过细胞膜以外，还应该存在其他的机制，因为许多细胞对水的通透性的掌控要比简单扩散能达到的程度高得多，而且如果水仅仅通过被动扩散机制进出细胞，那么渗透压很容易导致细胞破裂或者细胞脱水（取决于细胞膜内外的盐浓度）！但这种机制究竟是什么却一直悬而未决，直到约翰霍普金斯大学的Peter Agre在细胞膜上发现了水通道蛋白（aquaporin，AQP）。水通道蛋白发现的故事再次验证了“运气只会眷顾那些有准备的人”这句至理名言。在20世纪80年代中期，Agre及其同事在红细胞膜上寻找作为Rh-因子（Rh-factor）一部分的蛋白质，偶然得到一种含量丰富、非常小的蛋白质“不速之客”。他们很快分离到这种蛋白质，并将它命名为CHIP28（28表示它的大小是28103），而且发现它也存在于肾脏细胞等细胞膜上。很快，他们用了不到一年的时间测定出它的氨基酸序列并克隆到它的cDNA。考虑到这种蛋白质也存在于与水代谢密切相关的肾细胞的细胞膜上，于是他们就想：也许它就是组成水通道的蛋白质！为了证明这种推测，他们构建了CHIP28表达质粒，随后，把构建好的质粒显微注射到非洲爪蟾（Xenopus Laevis）的卵里进行表达。当他们将含有CHIP28表达质粒的卵放到低渗介质中以后，发现细胞迅速发生膨胀，而没有CHIP28表达质粒的卵形状没有变化。此外，他们还将CHIP28重组到脂质体上，结果也发现这种人造细胞也能够从低渗溶液中吸水膨胀。当他们将Hg2+与CHIP28混在一起的时候，发现Hg2+能使CHIP28失活，这种结果解释了Hg2+能够阻止水的跨膜运输这个很早就为人所知的现象，综合以上的实验结果，可以毫不怀疑地认为，他们发现的CHIP28就是水通道蛋白。2000年，Agre和其他的几位科学家得到了他们最先在红细胞上发现的水通道蛋白（现在被称为水通道蛋白-1）的三维结构。水通道的三维结构清楚地表明，其肽链两个部分形成的半孔（hemipore）组装成了一个允许水分子通过的通道。水通道的发现迎来了对这种存在于各种生物的蛋白质进行生化、生理学和遗传学研究的黄金时代，对于它的研究可以更好地揭示生命现象，使科学家能够研发出一些治疗因水通道异常而引发的疾病。Agre因此荣获2003年的诺贝尔化学奖。水通道蛋白理论在诊断中的应用研究已证实AQP1可促进肿瘤血管生成和血管内皮细胞迁移，最新研究发现在肝硬化过程中，AQP1可增强水的渗透率，加速了成纤维细胞生长因子诱导的肝窦内皮细胞膜的皱缩。从而促使病理性血管生成4，韩等5在水通道蛋白理论及基础上，构建大鼠肝纤维化模型，进行13NH3-H20的PET/CT成像，建立三室模型，从而证实大鼠肝纤维化过程中，13NH3-H20从组织间隙到血管内皮细胞转运的过程与AQP1数量及分布有密切关系。也有相关文献报道，AQP1在乳腺癌、神经母细胞瘤以及骨髓瘤等多种肿瘤内高表达1。在非肿瘤疾病方面，AQP1在类风湿关节炎滑膜细胞膜的表达增加所引起的水代谢及转运机制障碍可能是滑膜炎症和关节腔积液形成的机制之一6。另外，Gao等7在大鼠实验中证实AQP1的高表达与肺损伤和肺纤维化有密切关系。AQP2是抗利尿激素调控的水通道蛋白，与肾源性尿崩症存在一定关系。当AQP2表达异常时，抗利尿激素不再受AQP2调控，失去与肾脏的抗利尿激素受体的相互作用，以致肾小管不能浓缩尿液。AQP3属于水甘油通道蛋白，其表达引起的甘油转运是一些细胞增殖的关键因素。缺失AQP3的小鼠表现为皮肤干燥，结肠上皮细胞再生和角膜的修复延迟。这是因为AQP3的缺失影响了甘油的代谢和生物合成，使得三磷酸腺苷(ATP)减少，并且阻碍了促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)的信号传导8。AQP4在大脑和脊髓中广泛表达，特别是参与形成血-脑屏障的星形胶质细胞周足处以及室管膜和软脑膜上皮1。AQP4与癫痫有着密切的关系：缺乏AQP4的转基因小鼠癫痫发作时间显著延长，这可能与细胞外K+间隙和间隙连接耦合的改变有关。癫痫的组织中发现K+在体内平衡紊乱、上调，并且AQP4亚细胞分布发生改变9。同时，AQP4在视网膜、内耳和嗅觉器官上皮组织中也有表达。AQP4参与大鼠的神经兴奋性活动，会造成视觉、听觉和嗅觉障碍，比如视神经脊髓炎，并且随着AQP4数量的增加，开始发作的阈值减低，发作的时间和强度增加10。对于小鼠因急性水中毒和缺血性脑卒中发生的脑水肿(以细胞毒性脑水肿为主)，AQP4的缺失则可以减低发病程度，降低死亡率，但AQP4的缺失会阻碍血管性脑水肿的恢复1，11。AQP5主要分布于肺的I型细胞、上气道的分泌上皮细胞，其功能的异常与部分肺疾病相关。肺水肿时，肺毛细血管壁通透性增加，血管内液体首先在支气管周围聚集，进而渗入肺间质及肺泡内。在氧中毒性肺水肿模型大鼠的研究组发现，大鼠肺内AQP1和AQP5都出现不同程度的下调，因而认为当急性肺损伤时，在水的清除过程中AQP1和AQP5起到了调节作用。然而它们的作用过程并不完全一致：在清除支气管和脉管周围组织的水分环节中，AQP1作用更突出，而AQP5则主要清除肺泡腔内的水分。AQP5在腺体细胞也有表达。食管癌病人的免疫组化染色显示AQP5的表达与肿瘤大小、组织学类型和肿瘤复发有关12。与正常组织比较，AQP5在胃癌组织中也有高表达13。乳腺癌发展过程中，AQP5的高表达与乳腺导管上皮细胞极性的丧失有很大的关系14。AQP6存在于肾集合管具有H+-ATP酶的细胞囊泡中，可能参与了胃酸的分泌。在pH值较低时，AQP6独特的阴离子渗透性被激活，在大鼠实验中证实慢性中毒与水负荷增加时，AQP6的表达显著增加15。AQP7主要定位于毛细血管内皮细胞内脂肪组织，参与甘油调节，近35年未有突破性研究发现。AQP8主要分布于消化系统和生殖系统，具有维持体液和电解质平衡的作用。研究表明AQP3和AQP8在肠道炎症和损伤时表达增加16。AQP8虽然在大脑中分布少，但在人脑低级别星形细胞瘤的细胞质中表达增加，在高级别星形细胞瘤中表达进一步增加，尤其是恶性胶质瘤17。因此推测AQP8可能有助于人脑星形细胞瘤的增殖。在特发性羊水过多的胎盘与胎膜上，AQP8也有着高表达18，这说明AQP8在羊水量的调节上有着重要作用。AQP9属于水甘油通道蛋白，敲除AQP9的大鼠，明显患有高甘油血症和高甘油三脂血症，这说明AQP9可能参与肝脏甘油的摄取和葡萄糖的代谢19。AQP9也存在于神经节细胞，研究发现眼压升高时。啮齿类动物的视网膜神经节细胞死亡增加，此时AQP9表达减少20。这一结果可能是因为AQP9表达的缺失影响视网膜神经节细胞存活。目前关于AQP1012的研究较少，AQP10仅仅表达于脂肪细胞，甚至在有些动物中发现其是假基因：部分研究者认为AQP10的缺失可能与人类肠结核有一定关系21-22。AQP1112是水通道蛋白家族新亚型，也叫超级水通道蛋白，AQP11与细胞内质网联系紧密，并且在肾小管上皮细胞高表达。实验发现，在敲除了AQP11的小鼠中发现了新生的、致命的多囊肾23。AQP12是新近发现的哺乳动物水通道蛋白家族的成员，在胰腺腺泡细胞特异表达。AQP12定位在细胞内的细胞器，在快速和强烈的刺激下控制胰液的适当分泌24。水通道蛋白理论在医学成像技术中的应用扩散加权成像技术MR扩散加权成像(diffusion weighted imaging，DWI)能够为活体水分子的分布及运动等特征提供重要信息，并已经成为对脑、肝和前列腺等行MRI检查的常规方法。测量组织细胞间隙水分子扩散信号，其减弱的程度与水分子运动速度相关，用扩散敏感度b表示。根据不同的b值获得的影像所测量的信号值就可以用表观扩散系数(ADC)表示。总结归纳ADC值的变化与组织内水分子变化之间的联系，再以病理为基础，进而研究疾病与AQPs之间的关系。目前利用此技术的研究较多，且获得初步结论。有动物实验结果表明AQP4基因表达与局部ADC值呈较强的负相关，而在急性脑梗死时局部ADC值与DWI上信号的高低亦呈负相关25-26。以乳猪为模型，动态观察研究乳猪脑缺血和再灌注后组织ADC值与AQP4之间关系，两者呈正相关(r=0.875)，并发现在乳猪脑缺血和再灌注6 h后ADC值达到最低27。研究表明鼠脑积水时，出现AQP4高表达现象，ADC值与AQP4之间具有很好的相关性28。动物实验和临床研究结果表明ADC值与肝硬化程度呈负相关29-31。随着b值提高，良性病灶信号迅速降低。而恶性病灶仍然保持相对高信号，当b值为600 s/mm2时，其可鉴别肝脏病灶的良恶性，并已获得满意的临床结果32。 分子成像技术PETCT是将CT解剖影像与PET功能、代谢和分子成像影像相融合，可从分子水平无创、定量测定人体内代谢变化。Nakmura等33利11C标记2-(烟酰胺)-1，3，4-噻二唑2-(nicotinamide)-1，3，4-thiadiazole，TGN-020作为AQP显像剂，结果发现其能够与AQP4和AQP1结合。进而证明AQP4和AQP1在小鼠组织内分布。韩等5以13NH3-H20为显像剂，乙酰唑胺为抑制剂，通过PET/CT成像，获得肝纤维化大鼠血流在肝脏内的灌注、扩散及代谢的三室模型，通过不同时间点SUV值的测定，证实AQP1与肝纤维化的不同分期有密切关系。 CT灌注及超声造影技术目前也有关于CT灌注成像及超声造影评价肝纤维化及肝硬化的研究，其都是从宏观上对肝脏血管的改变进行评价。研究发现在肝硬化的过程中，病理性血管生成与AQP1有着密切关系，因此结合分子免疫可能在水通道蛋白的研究中有所发现，然而临床中要考虑到CT灌注及超声造影对病人存在的损伤性。 水通道蛋白理论在治疗学中的应用目前关于水通道蛋白与疾病的研究越来越多，并且发现他们之间存在联系，这为临床诊断奠定了基础，同时也为疾病治疗提供了新的思路。目前存在两种分子治疗方法，一是利用小分子单克隆抗体，但进展缓慢；另一种为利用AQPs抑制剂。然而关于AQP抑制剂的报道很少，并且意见不一。虽然许多水通道蛋白被巯基反应水银剂(如汞、汞金)所抑制，但由于这些金属离子对AQPs的抑制是非选择性的，并且本身存在很强的毒性，因此不宜应用于临床。关于AQP1的抑制剂有很多报道，包括四乙胺、乙酰唑胺和二甲基亚砜。然而部分研究者在使用敏感的测量方法评估四乙胺和乙酰唑胺的抑制作用效果后，发现其抑制作用很小甚至没有；二甲基亚砜产生的抑制作用也尚不明确34-37；而岳等6在实验组证实乙酰唑胺对A