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文档简介
生物技术:应用自然科学及工程学的原理,依靠生化催化剂的应用,将物料进行加工以提供产品货位社会服务的技术发酵:一切依靠微生物的生命活动来获取产品培养基:提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的按一定比例配制的多种营养物质的混合物生理酸性盐:经过微生物生理代谢后,生成酸性物质的无机盐致死温度:杀死微生物的极限温度致死时间:致死温度下杀死所有微生物的时间灭菌:利用物理和化学的方法灭菌或除去物料及设备中一切生命物质的过程消毒:用物理或化学的方法杀死物料.容器.溶具内外的病原微生物,一般只能杀死营养细胞而不能杀死芽孢。相对热阻:某一微生物在某些条件下的致死时间与另一微生物在相同条件下的致死时间的比值。生长因子:构成细胞的组分,促成生命活动的进行的物质。相对浓度:指空气的饱和度百分数,在一定温度,罐压和通气搅拌下,以消后培养基被100%饱和为基准,发酵液中溶解氧所占比例。热阻:微生物在某条件下的致死时间连消灭菌:也叫连续灭菌,培养基在通入到发酵罐的过程中进行加热,保温,降温的过程共价修饰:通过酶蛋白中的残基与一些化学基团的共价解离变构效应:又称别构效应,一种小分子物质与酶分子上的相应部位非共价结合后改变酶分子构想,从而改变酶的催化活性初级代谢:微生物在生命活动前期进行的与其生长繁殖相关的活动初级产物:微生物在生命活动前期产生的与其生长繁殖密切相关的产物次级代谢:微生物在生命活动后期进行的与其生长繁殖无关的活动OD:光密度(反映条件) 种子扩培级数:是指制备种子需逐级扩大培养的次数,与生产规模和菌种生长特性有关,保证种子液数量,尽量缩短级数发酵级数:菌体细胞在生产车间经历的液体培养次数种龄:种子罐中培养的菌丝体开始移入下一级种子罐或发酵罐的培养时间接种量:接入的种液的体积和接种后培养液的体积比溶解氧浓度(DO):在一定温度和压力下,发酵液所溶解的氧气浓度相对浓度:又称空气的饱和度百分数,指在一定温度,罐压和通气搅拌,以消后培养基被100饱和为基准,发酵液中溶解氧所占的比例耗氧速率ro2:单位体积的发酵液在单位时间内耗氧量,反映了发酵液中对氧气的消耗量呼吸强度Qo2:单位质量的干菌体在单位时间内的耗氧量临界氧浓度C临:生长期时不影响菌体细胞呼吸所允许的最低氧浓度,生产期时不影响产物合成所允许的最低氧浓度生物工艺过程:菌种优化发酵种子制备发酵提取产品生物技术的特点:1、反应条件温和;2、原料无毒无害,生物体也如此;3、反应过程与自我调节方式进行;4、高分子化合物的转化。pH的控制:1.生长期和生产期所要求的pH相同:pH本身不变:调节培养基初始pH值pH发生变化:加pH缓冲盐;2.两阶段要求pH不同:流加酸碱或补料DO对发酵的影响:若DO不足,引起菌体细胞代谢的影响,影响产物合成,改变产物种类;若DO过剩,会引起超氧化物,过氧化物以及自由基,可加入超氧化歧化酶来抗氧化,清除自由基影响DO的因素:1.供氧:搅拌:增大气体接触面积和传递面积形成涡流延长气体在液体中的停留时间增强液体的湍流程度,减少液相阻力减小菌丝结团,减少气体在菌丝中传递阻力降低细胞周围废气废物浓度,有利于代谢叶轮,挡板空气流量氧分压罐压发酵液性质;2.耗氧:呼吸强度临界氧浓度基质工艺:快速利用碳源,耗氧多DO控制:加大搅拌速度,流量及罐压溶氧作为发酵异常的指标:菌体代谢异常污染杂菌操作故障或设备故障生物技术所涵盖的学科:基因工程细胞工程发酵工程酶工程蛋白质工程培养基以生产工艺分类:1. 孢子培养基:要求:营养物质不能太丰富(避免添加有机氮源,游离氨基酸)水分要适中(20-25)2. 种子培养基:供孢子发展,萌发菌丝体,菌丝体快速生长为生命力强的种子;要求:营养丰富完全,快速利用碳氮源,含无机盐和生长因子黏度不宜太大最后一级种子培养基营养成分与发酵培养基尽量接近3. 发酵培养基:使种子大量繁殖,合成产物;要求:营养成分除了满足菌种生长,还满足合成产物需要营养成分,需加前体,促进剂,抑制剂原料的利用率高,副产物及“三废”产物少原料因地制宜,价格低廉,性能稳定培养基选择原则:不同微生物的营养特性,酶系不同不同目的理化条件:pH,渗透压,水活度经济节约发酵培养基选择原则:1、营养要满足合成产物的特定物质,满足微生物生长所需;2、原料利用率要高,三废物质及副产物要少一些;3、原料要应地制宜,价格低廉,性质稳定。发酵工业常用原料:1. 碳源:供给生命所需能量,构成菌体细胞核产物的碳骨架糖类:葡萄糖(特点:快速碳源,促进菌体细胞的生长;注意合理利用,多量使用会产物合成抑制,代谢方向改变,生理环境不良变化)乳糖蔗糖淀粉(慢速碳源)糖蜜;油脂:甘油+脂肪酸(消泡剂,氧气需充分供应)有机酸:促进产物合成;烃、醇2. 氮源:构成菌体细胞物质和组合含氮产物有机氮源:特点:利用速率慢,营养成分全面;作用:促进微生物提供营养物质,生长因子和维生素提供产物的氮骨架和前体物质提高酶的催化活性;无机氮源:特点:细胞利用速度快,营养成分比较单一易引起pH的变化;生理酸/碱性盐:调节环境pH,提供氮源快速碳氮源和慢速碳氮源的应结合使用。3. 无机盐及微量元素:作用:构成菌体细胞的成分及产物的成分作为酶相关的组成部分或激活剂或抑制剂调节细胞的渗透压;注意问题:适量使用不同无机盐及微量元素相互作用,避免有效量的降低磷酸盐:磷脂结构的构成促进细胞生长,组成核酸能量传递作用磷酸盐缓冲液调节pH;硫酸盐:构成细胞的内容物及含硫的产物辅酶的活性基团;金属离子盐:调节渗透压改变细胞的通透性可作为多种酶的辅基;微量元素:不额外加入细胞的组成成分辅酶的辅基生长因子:微生物生长不可缺少又不可自身合成,不额外添加,选择富含生长因子的原料水:培养基的组成微生物吸收排泄介质调节细胞温度前体、促进剂、抑制剂:前体:加入到培养基中能直接结合到产物中,而其自身结构无变化,但产量却大量提高(提高合成的效率,调节代谢过程),有利于分离提取;促进剂:非细胞所需的营养物质,也非前体,但能提高产物产量促进细胞生长推迟菌体的自溶,增加细胞的通透性调节菌体的代谢改善发酵液的性质降低发酵液中产物的浓度;抑制剂:抑制一种途径而是另外一种途径活跃起来前体的副作用:前体一般为菌体次级代谢产物,在产物合成阶段加入,对菌体细胞一般具有一定的毒性。消除办法:一般进行分批滴加,或定量流加来完成,也可进行稀释。配制培养基应注意的问题:快速利用碳氮源与慢速利用碳氮源要结合起来使用选择一个合适的碳氮比生理酸碱性盐及pH的调节剂配合使用影响培养基质量的因素:原材料的品种和质量水质的影响灭菌的影响灭菌的方法:干热灭菌:置于高温160下1-2h使蛋白质变性;适用保持干燥的实验器具湿热灭菌:121水蒸气汽化放热使蛋白质变性;适用培养基,设备和管道;灼烧法灭菌:适用接种针/环/口及空气电磁波和射线:适用固体表面,空间化学法灭菌:浸泡化学试剂反应使遗传物质变性,适用器具,材料,环境过滤除菌:适用热敏性的液/气体工业生产中培养基的灭菌:1.湿热灭菌:实消灭菌:适用于小型黏度大,固形物多培养基灭菌流程:配料罐-发酵罐-通蒸汽-140维持一阵时间-通气-降温连消灭菌:适合大型黏度小的培养基灭菌流程:配料罐-预热器/残热回收器(90-120)-加热器(40)-维持管实消和连消的特点对比:优点缺点实消附属设备少;二次污染几率低营养成分损失多;发酵罐利用率低,能耗利用低连消高温瞬时灭菌,营养成分损失较少;发酵罐的利用率高,能耗利用高;分开灭菌,避免反应,提高利用率设备多;二次污染几率大;不适合黏度过大,固形物含量高基本代谢调控:1.酶活性调节:共价修饰;变构控制:I变构酶的特性:多亚基结构:a.活性中心:起催化作用b.调解中心:与效应物结合(可逆)反馈抑制作用:产物会抑制酶的活性脱敏作用:经过特定处理后,不丧失酶的活性而失去对效应物的敏感性II方法:变构酶解聚:保留活性中心,解离调节中心从而失去对效应物的敏感性基因突变:使编码基因突变2.酶合成的调节:酶合成的诱导代谢调控:微生物的发酵过程中添加诱导类似物敲除调节基因代谢产物的反馈阻遏代谢调控:降低胞内产物浓度,增加细胞通透性敲除调节基因分解代谢物阻遏3.针对基本代谢的调控思路:改变酶活性变构酶的脱敏作用基因水平去阻遏添加诱导物降低终产物在胞内浓度:添加表面活性剂使细胞膜合成适当受阻降低发酵液中终产物浓度造成浓度差初级代谢的特点:代谢产物生成速率越大,细胞生长速率越快次级代谢的特点:产物不参与细胞的生长繁殖产物合成至少部分受到与初级代谢无关的遗传物质控制产物发酵经历菌体生长期和生产期两个阶段:代谢过程中酶系的专一性差次级代谢调控:基本代谢调控前提物质调控工业生产常用的微生物:1.细菌:营养特性:不能利用多糖,工业上用淀粉水解糖质为碳源;培养特性:个体小菌体浓度升高不易引起发酵液黏度增加,不致引起太大的供氧压力对搅拌引起的剪切力不敏感,供养无太高要求(工程菌除外);主要产品:氨基酸,维生素,蛋白质;2.放线菌:营养特性:可利用多糖(微碱性);培养特性:丝状菌菌体浓度升高对培养基黏度影响大,不能大量使用快速碳源对搅拌引起的剪切力敏感,纵向挡板可减轻剪切力;主要产品:抗生素,链霉素,四环素;3.霉菌:营养特性:可利用多糖;培养特性:同放线菌;主要产品:酶制剂,青霉素,头孢菌素,生物碱;4.酵母菌:活菌制剂;5.担子菌:萜类化合物工业发酵对菌种的要求 :1.生长速度快,发酵单位高;2.遗传性能稳定3.具备抗感染能力4.能量要求低,工艺易于控制5.代谢产物无毒害作用生物工艺发酵过程控制参数:pH值温度溶氧基质含量:主要是残糖和残氮空气流量压力搅拌转速搅拌功率黏度浊度料液流量产物浓度(分析相互影响与联系)温度对发酵的影响:温度对细胞生长的影响:酶活性对基质的利用:改变细胞的结构,改变基质溶解度及传质速度对细胞生长速率;温度对产物合成的影响:酶活性影响代谢方向影响代谢调控机制影响发酵液的物理性质影响温度的因素:生物热:呼吸强度搅拌热蒸发热辐射热pH对发酵影响:对细胞生长:细胞体内酶活性对产物:产量、产品种类、产物稳定性pH对发酵过程的影响:细胞质膜电荷酶活性营养基质和代谢产物的解离情况影响pH变化的因素:细胞本身基础培养基的组成:C/N/无机盐代谢产物发酵条件:溶氧和消泡发酵异常分批发酵法:(单罐深层分批发酵)每一个分批发酵过程都要 经历接种、生长繁殖、菌体衰老而结束发酵,最终提取出产物。特点:1.细胞所处环境不断变化(发酵周期有限制)2.不易染菌(染菌后易终止操作)3.操作简单4.适合多品种发酵补料分批发酵法:(半连续发酵,半连续培养):在分批式发酵过程中,间歇或连续地补加新鲜培养基的方法。特点:1.避免加快利用C、N源带来的问题2.避免产生对细胞有毒害的物质3.可补加基质连续发酵法:当微生物培养到对数生长期时,在发酵罐中一方面以一定速度连续不断的流加新鲜液体培养基,另一方面以同样速度连续不断的将发酵液排出,使发酵罐中微生物的生长、代谢活动始终保持旺盛的稳定状态.特点:1.细胞所处环境稳定,延长生产期2.易染菌3.附属设备多,成本高4.对产品的反馈抑制可有效的消除。+生物工艺工程:菌种保藏菌种活化种子制备发酵(以上四步在培养基中完成)提取产物微生物的热死(对数残留定律):1、微生物的个数减少速度与任意瞬时残存菌数成正比;2、K值表示微生物的耐热性能(比死亡率,K值越高,比死亡率越高,反应速度加快,细胞死亡速度加快);3、对于同种微生物,温度越高,K值越高(相同温度的不同细胞,K越大,越不耐热,K值在特定温度、特定菌种为定值)。扩大培养:1、菌种选育 分为自然选育和菌种改良; 2、菌体扩培菌种选育过程:采集菌种增殖培养纯种培养纯种培养:划线接种初选50-100株复筛出目标菌株菌体扩培过程:保藏菌种活化 种子制备 发酵恢复活力:由休眠体变成繁殖体过程 易除去退化的菌种子扩配的任务:为发酵岗提供相当数量和质量的种子种子扩配的要求:1、种子液中菌体数量和浓度符合要求;2、菌体活力要强3、生产性状和生理性能要稳定4没有菌体污染种子扩培级数:在保质保量时应尽量缩短培养级数发酵级数=种子扩培级数+1扩培工艺:细菌 取菌斜面活化扁瓶培养入种子罐放线菌霉菌可直接入发酵罐 也可经过摇瓶培养后入种子罐接种量:接入种子液体积和接种后培养液体积之比接种作用:为下一级提供菌种 使菌体在新环境中能适应谷氨酸代谢途径:1、代谢途径2、调控思路3、如何实施:筛选菌种:谷氨酸棒杆菌,酶1活性低,酶2活力高,并将其筛选成生物素缺陷性菌株;生产过程:发酵前期,充分供给生物素(供能,使菌体快速生长繁殖);发酵后期(即生产期),限量供给生物素(二氧化碳固定酶系的活力要保证)泡沫的消除:1.调整培养基的成分2.采用机械消泡或消泡剂消泡3.筛选不产生流态泡沫的菌种发酵用空气所需达到的要求:气流和压强(0.12vvm),相对湿度(70%)。洁净程度。空气净化的方法:热灭菌法.静电灭菌.介质过滤除菌法。空气净化流程:吸气口吸入粗过滤器过滤空气压缩机压缩冷却除油水加热降湿度过滤器净化空气。RG:残糖,延滞期,细胞数目少,变化缓慢;对数期,细胞数目急剧升高稳定期,糖的小昊主要用于产物的合成。在线检测对传感器的要求:耐高温、高压;探头稳定性好,使用维护方便;探头不易堵塞;价格合理,便于推广。发酵培养特性:浓度大,培养液呈纸浆状,接种量小于5%,引起黏度增加,慢速碳源,搅拌速度慢。自然选育菌种(1)样品采集:根
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