《七种观察方式》PPT课件

显微观察方式 奥林巴斯光学北京办事处 齐冬 观察方式 1 明场观察2 暗场观察 暗视野 3 相差观察 相衬观察 4 偏光观察5 DIC观察 微分干涉 6 RC观察 浮雕相衬 7 荧光观察 一 明场观察方式 常规观察方式应用领域 常规镜检 病理 染色标本优点 视野亮度高 均匀 应用范围广 操作简单 价格低 物镜适用于荧光观察缺点 透明标本对比度低 标本没有立体感 明场观察显微镜的调节 瞳距调节屈光度调节光路转换聚光镜中心孔径光栏设置 瞳距调节 刻度指示 屈光度调节 调节 屈光度调节指示 光路转换 100 80 20 100 聚光镜中心调节 光轴中心调节螺钉 视场光阑 孔径光阑 10X物镜 标本 聚光镜升降旋钮 孔径光栏调节 N A聚 0 6 0 8 N A物 孔径光栏开度与图象 100 70 30 HRLC HCLR MRMC 二 暗视野观察方式 1原理丁道尔 Tyndall 现象 微粒对斜射光反射或衍射 增大了人眼可见性 2特点观察到极其微小物体 分辨率可达0 02 0 004um 明场0 24um 超显微 3缺点只能观察到物体存在 运动和外部形态不方便调节标本要求高 灰尘 盖片 载片 4应用 微小粒子 细菌形态观察 细菌记数 透明标本观察等 二 暗视野观察方式 三 相差观察方式 1原理利用被检物体的光程 折射率x厚度 差进行镜检 即利用干涉现象 将相位差变为人眼可以分辨的振幅差 共轭面 吸收光线 直射光通过 补偿面 相位推迟 衍射光通过 物镜相板 聚光镜环状光阑 三 相差观察方式 2特点鉴定活体细胞最实用 最经济的方法3缺点需要光强高切片不能太厚 2 10um 盖片 载片需符合标准最好配用单色滤光镜操作较麻烦荧光效果不如明场物镜 三 相差观察方式 4应用 无色透明活体标本的细微结构 检查 鉴定活体细胞 培养细胞 分离细胞 三 相差观察方式 5调节 苛勒照明调节将相差物镜及附件转入光路 物镜 聚光镜相衬环型号匹配 对样品聚焦取下目镜 装上CT望远镜 调节CT焦距看到清晰的相差环调节聚光镜上定位螺丝 使环状光阑象与相板共轭面重合 四 偏光观察方式 1原理依据波动光学原理观察和精密测定标本细节 或透明物体改变光束的物理参数 以此判别物质结构的一种显微镜 自然光 多振动面 偏振器1 偏振器2 偏振光 单一振动面 各向同性 单折射体 光性质不因照射方向而改变 普通气体 液体 非结晶固体等各向异性 双折射体 光速度 折射率 吸收和振动面 振幅随照射方向不同 晶体 纤维等 四 偏光观察方式 应用 矿物质 化学物品鉴别鉴别纤维 染色体 淀粉粒 细胞中晶体植物病理检验鉴别骨骼 牙齿 胆固醇 神经纤维 肿瘤细胞 横纹肌和毛发等 五 微分干涉 DIC 观察方法 五 微分干涉观察方法 1原理通过特制的棱镜将偏振光分解相互垂直 强度相等的光束 光束载极近的两点 小于显微镜的分辨率 上通过被检物体 从而在相位上略有差别 使图象呈现出立体三维感觉 五 微分干涉观察方法 2特点可以使被检物体产生三维立体感觉观察效果更直观无须特殊物镜 与荧光观察配合更好可以调节背景和物体的颜色变化而达到理想的效果 五 微分干涉观察方法 3缺点需要光强高 双折射物质不能达到DIC镜检效果 不能应用于塑料容器培养物的观察 镜检灵敏度有方向性 调节较复杂 4应用 无色透明活体标本的细微结构 无色荧光标本 染色标本 显微操作等 五 微分干涉观察方法 六 浮雕相衬显微镜 六 浮雕相衬显微镜 1原理斜射光照射到标本产生折射 衍射 光线通过物镜光密度梯度调节器产生不同阴影 从而使透明标本表面产生明暗差异 增加观察对比度 2 历史1975年 RobertHoffman博士发明2002年 专利到期 各显微镜厂家纷纷推出采用以自己名义命名的RC技术产品3 特点提高未染色标本的可见性和对比度 图象显示阴影或近似三维结构而不会产生光晕 可检测双折射物质 岩石切片 水晶 骨头 可检测玻璃 塑料等培养皿中的细胞 器官和组织 聚光镜的工作距离可以设计的更长 RC物镜也可用于明场 暗场和荧光观察 六 浮雕相衬显微镜 4 缺点观察效果与标本方向密切相关操作较复杂必须有多元件 结构复杂的高数值孔径RC物镜观察荧光效果不如明场物镜5 应用所有类型的细胞 组织 无论活体 染色 未染色 晶体表面细节 透明聚合物 玻璃和其它类似材料 尤其适用于显微操作 六 浮雕相衬显微镜 荧光观察方法 什么是荧光 物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态 再回到低能状态时释放出的光 是非温度辐射光 冷光 即 物质吸收短波光 发射出的长波光 显微镜荧光利用光源激发 光化荧光 荧光的种类自发 固有 荧光二次荧光 荧光显微镜的作用原理 宽谱线发射光 汞灯 滤掉其他光 透过激发光 激发滤色片 吸收滤色片 滤掉激发光 透过荧光 标本受激发产生荧光向四周发散 激发光受反射 折射或衍射向四周发散 荧光的性质 吸收光 必需有激发光源荧光波长 激发波长 损失热能 荧光强度极小于激发光的强度有不同程度的衰减荧光强度取决于激发光强度 被检物浓度 荧光效率 荧光显微镜的优点和用途 优点 检出能力高 放大作用 对细胞的刺激小 可以活体染色 能进行多重染色用途 物体构造的观察 荧光素荧光的有无 色调比较进行物质判别 抗体荧光等发荧光量的测定对物质定性 定量分析 荧光显微镜的种类透射式 荧光显微镜的种类落射式 荧光显微镜的主要部件 透射式吸收滤色镜暗场聚光镜激发滤色镜汞灯光源 落射式吸收滤色镜分光镜激发滤色镜汞灯光源 落射荧光显微镜的构造 吸收滤色镜 激发滤色镜 落射荧光显微镜的构造 荧光显微镜光源 汞灯光源 提供激发光 U V B G 氙灯光源 高峰值更宽 更稳定 荧光显微镜激发透镜组 激发滤色镜 激发波长选择 激发透镜组 激发块 T nm BANDPASS 入射光 发射光 激发滤色镜 分光滤色镜 吸收滤色镜 落射荧光显微镜各部件特性和作用 吸收滤色镜 荧光透过 阻挡杂光 分色镜 反射激发光 荧光透过 A透过 A A反射 B B透过 B阻挡 nm nm T T A 落射荧光显微镜各部件特性和作用 吸收滤色镜 荧光透过 阻挡杂光 分色镜 反射激发光 荧光透过 A透过 A A反射 B B C透过 nm nm T T A C 滤色镜的选择 荧光素的特性 滤色镜的特性 激发 分色 吸收 带宽对图象的影响 SWB BP420 480 WB BP450 480 WIB BP460 490 NB BP470 490 FITC PI 多重染色标本的多色观察 FITC TexasRed DAPI 三色滤色镜的特性曲线 激发 分色 吸收 双重染色标本的单色和双色观察 WU WIB DUALBAND WIBA WIG WIB DAPI FITC FITC PI 单色滤色镜的特性曲线 双色滤色镜的特性曲线 现行显微镜特点和各种滤色镜 自由组合激发块 吸收滤色镜 激发滤色镜 分色镜 油镜应使用荧光油 物镜光栏的运用 光栏全开启 光栏适当关小 减少杂散光干扰 荧光的衰减 防衰减的方法使用抗衰减剂选择衰减小的荧光素降低激发光强度降低标本中氧的浓度 有衰减的标本 使用抗衰减剂的效果 汞灯灯箱构造 灯室 上下 左右旋钮 聚光镜旋钮 汞灯中心调节方法 放置荧光调中板或一张白纸于载物台上转入B或G激发滤色镜用10X物镜观察并聚焦取下10X物镜通过汞灯箱上聚焦旋钮聚焦汞灯电极于白纸通过汞灯箱上下