细胞活性测定

1 5 细胞活性测定方法细胞活性测定方法 细胞活性指标通常包括细胞膜对核酸染料的通透性 代谢活性 膜电位等 核酸染料 有多种 如 EB 带有单个自由正电荷 能通过完整细胞膜 而 PI TO PRO 1 TO PRO 3 等等带一个有四铵基团和两个或两个以上正电荷的染料是不能通过完整细胞膜进入 细胞内的 因而吸收了这些多电荷染料的细胞被认为是非活性的 另外 一些酸性染料 如上面提到的台盼兰 曙红等都是膜非通透性 代谢活性是另一重要指标 它通过细胞内的酶的活性来判定 使用细胞某种酶的底物 它能通过 或是不能通过 完整细胞膜 在细胞内被酶切而产生荧光性 膜不通透性产物 能在细胞膜完好的细胞内存留 在细胞膜不完整的细胞内散失很快 通过检测荧光强度就 可知细胞代谢活性 FDA fluorescein diacetate 和 CTC 5 cyano 2 3 ditolyl tetrazolium chloride 是常用的两种底物 前者虽然透过细胞膜的速度较慢 但它的产物基本不往外通 透 后者经细胞内脱氢酶催化而具有荧光性 能提供细胞呼吸代谢系统活性和细胞膜完整 性信息 正常细胞的细胞膜两侧维持着一个胞内为负的膜电位为梯度 带正电的亲脂性染料 如 Cyanines 类能因电梯度而通过细胞的脂双层膜聚积在活细胞内 带负电的亲脂性染料如 oxonols 会被排除在外 不再维持着膜电位梯度的细胞里 则会吸收更多 Oxonols 类染料 用流式细胞仪测量的方法优点是 灵敏 荧光强度精确定量 快速高通量的检测逐个 细胞 可同时检测细胞的多个活性指标 提高可信度 结果具有统计意义 缺点是 实验 较 MTT 等复杂 费用较高 常用的细胞活性测定方法有台盼蓝染色法 克隆 集落 形成法 3H 放射性同位素掺 入法 MTT 法等 其中 MTT 法以其快速简便 不需要特殊检测仪器 无放射性同位素 适合大批量检测的特点而得到广泛的应用 但 MTT 法形成的 Formazan 为水不溶性的 需 要加有机溶剂溶解 由于在去上清操作时会有可能带走小部分的 Formazan 故有时重复性 略差 为了解决这个问题 研究人员又开发了很多种水溶性的四氮唑盐类 如 XTT CCK 8 WST 8 等 1 MTT 法法 MTT 化学名 3 4 5 二甲基噻唑 2 2 5 二苯基四氮唑溴盐 商品名 噻唑蓝 检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性 MTT 还原为水不溶性的蓝紫色结 晶甲臜 Formazan 并沉积在细胞中 而死细胞无此功能 二甲基亚砜 DMSO 能溶解 细胞中的甲臜 用酶联免疫检测仪在 490nm 波长处测定其光吸收值 可间接反映活细胞数 量 在一定细胞数范围内 MTT 结晶形成的量与细胞数成正比 该方法已广泛用于一些生 物活性因子的活性检测 大规模的抗肿瘤药物筛选 细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测 定等 它的特点是灵敏度高 经济 缺点 由于 MTT 经还原所产生的甲臜产物不溶于水 需被溶解后才能检测 这不仅使工 2 5 作量增加 也会对实验结果的准确性产生影响 而且溶解甲臜的有机溶剂对实验者也有损 害 MTT 法显色的条件 1 pH 值值对 MTT 实验结果的影响 MTT 实验体系的 pH 值是影响实验结果的另一重要 因素 在偏碱性的环境中本底偏高 稳定性较差 随放置时间延长而升高 偏酸性试液 的实 验结果比较稳定 2 酚红和血清酚红和血清对 MTT 实验方法的影响 酚红是一种 pH 中性指示剂 血清是细胞生长必 需的营养成份 两者都是细胞培养液的基本成份 酚红在 pH7 0 以上试液中呈紫红色 在 570 nm 有较大光吸收值 血清蛋白在有机溶剂中容易变性形成絮状沉淀 影响透光度 3 异丙醇异丙醇等用作 Formazan 溶剂 无须酸化也能消除酚红的影响 为了消除酚红对 MTT 实验结果的影响 Mosmann 1983 提出用酸化异丙醇作 Formazan 溶剂 酸化异丙醇可将酚 红显示的紫红色转变为无色 Francois 1986 认为酸化异丙醇溶解 Formazan 改变了原光 谱特性 降低灵敏度 提出改用无酚红的培养基 未经酸化的异丙醇在一定条件下也可以消除 酚红的影响 异丙醇等有机溶剂本身为弱酸性 能够中和中性和弱碱性试剂 如 RPMI21640 pH7 3 当异丙醇与 RPMI 1640 的溶量比达到 1 1 以上时即可将酚红的紫红色转变 成无色 4 细胞代谢酶细胞代谢酶存在部位对 MTT 实验结果的影响 细胞线粒体产生的琥珀酸脱氢酶是细 胞生长代谢产物 这种酶裂解 MTT 形成 Formazan 是 MTT 实验方法的理论基础 琥珀酸脱 氢酶的产生和分布规律与 MTT 检验方法的灵敏度和稳定性有很大关系 5 MTT 使用浓度使用浓度选择 在不饱和状态下 或是细胞密度一定 MTT 不饱和 或是 MTT 一定 细 胞密度不饱和 Formazan 的生成量分别与 MTT 浓度和细胞分泌的酶活性量呈线性关系 达 到饱和状态以后 两者为非线性关系 为了提高 MTT 实验方法的灵敏度 在细胞密度一定的 条件下 应该使用 MTT 饱和浓度 MTT 的饱和浓度与细胞种类 细胞活力状态有关因此 MTT 最佳使用浓度要视情况而定 6 MTT 的酶裂解反应时间的酶裂解反应时间选择 MTT 在细胞培养体系中被细胞内线粒体产生的琥珀酸 脱氢酶裂解生成 Formazan 完成这一反应需要一定时间 MTT 裂解反应 2 5h 反应已基本 完成 3 h 反应相当完全 通常 MTT 实验应选择 3 小时的反应时间 7 MTT 的理化性质的理化性质对其条件影响很大 MTT 是一种黄色粉状物 溶于水性溶剂 也溶于有机溶剂 但在有机溶剂中的溶解力低于水 性溶剂 常温下需要较长时间才能溶解 MTT 水溶液在 pH 7 0 以下稳定 3 5 周内不变性 在 pH7 0 以上溶液中不太稳定 在异丙醇溶液中 1 周内变色 2 3 周内变成兰紫色 MTT 溶液呈黄色 在 410 nm 波长处有最大吸收峰 随波长增大吸收值很快下降 至 500 nm 处趋于 最低值 MTT 由酶裂解生成 Formazan Formazan 不溶于水性溶剂 易溶于有机溶剂 乙醇 丙 3 5 醇 异丙醇 乙二醇甲醚 DMSO 等都是比较好的溶剂 Formazan 的有机溶液呈兰紫色 细胞 增殖实验通常在聚苯乙烯培养板上进行 四氯化碳 10 SDS 和二氧六环对培养板有溶蚀 性 不宜使用 DMSO 和 SDS 对 Formazan 也有较好的溶解性 但凝固点太高 10 以下不 能用 丁醇等长碳链醇溶解 Formazan 后与水相不混溶 呈分层液 不适合作 Formazan 溶剂 2 XTT 法法 XTT 化学名 2 3 bis 2 methoxy 4 nitro 5 sulfophenyl 5 phenylamino carbonyl 2H tetrazolium hydroxide 作为线粒体脱氢酶的作用底物 被活细胞还原成水溶性的橙黄 色甲臜产物 当 XTT 与电子偶合剂 例如 PMS 联合应用时 其所产生的水溶性的甲臜 产物的吸光度与活细胞的数量成正比 优点 1 使用方便 省去了洗涤细胞 2 检测快速 3 灵敏度高 甚至可以测定较低细 胞密度 4 重复性优于 MTT 缺点 XTT 水溶液不稳定 需要低温保存或现配现用 3 CCK 8 法或称法或称 WST 8 法法 CCK 8 试剂中含有 WST 8 化学名 2 2 甲氧基 4 硝基苯基 3 4 硝基苯基 5 2 4 二磺酸苯 2H 四唑单钠盐 它在电子载体 1 甲氧基 5 甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯 1 Methoxy PMS 的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜产物 Formazan 生成的甲臜物的数量与活细胞的数量成正比 用酶联免疫检测仪在 450nm 波长处测定其光吸收值 可间接反映活细胞数量 该方法已被广泛用于一些生物活性因子 的活性检测 大规模的抗肿瘤药物筛选 细胞增殖试验 细胞毒性试验以及药敏试验等 优点 1 使用方便 省去了洗涤细胞 不需要放射性同位素和有机溶剂 2 检测快 速 3 灵敏度高 甚至可以测定较低细胞密度 4 重复性优于 MTT 5 对细胞毒性小 6 为 1 瓶溶液 毋需预制 即开即用 缺点 1 与 MTT 相比 CCK 8 和 XTT 的价格比较贵 2 CCK 8 试剂的颜色为淡红色 与含酚红的培养基颜色接近 不注意的话容易产生漏加或多加 由于是贴壁培养的细胞 在读吸光值时细胞培养板底部附着的细胞可能会对数值有一 定的影响 因此建议在加入 CCK 8 3 4 小时后 将上清液重新吸取到另一干净的酶标板 中进行读值 保证检测的准确性 要防止反复使用同一瓶试剂后可能造成的试剂污染 4 LDH 释放法释放法 酸脱氢酶 LDH 在胞浆内含量丰富 正常时不能通过细胞膜 当细胞受损伤或死亡 时可释放到细胞外 此时细胞培养液中 LDH 活性与细胞死亡数目成正比 用比色法测定 并与靶细胞对照孔 LDH 活性比较 可计算效应细胞对靶细胞的杀伤 本法操作简便快捷 自然释放率低 可用于 CTL 及 NK 细胞活性测定及药物 化学物质或放射引起的细胞毒性 现已有 LDH 法测定 CTL 活性试剂盒 promega 应注意较高浓度 FCS 中所含 LDH 可能 4 5 干扰结果 5 51 铬 铬 Cr 释放法 释放法 本法结果准确 重复性好 但也存在以下不足 使用放射性的 51Cr 不利于安全操作 及废物处置 且需特殊测定仪器 51Cr 自发释放率高 常因不同靶细胞标记效率变化差 别大而影响结果判定 51Cr 半衰期 27 8 天 无法用于需多次测定的动物试验 细 胞共育时间短而试验操作步骤多 不能在单个细胞水平进行测定 6 荧光测定法 荧光测定法 如 alamarBlue 一步荧光测定法 alamarBlue 为活细胞代谢指示剂 易溶于水 进入细胞后经线粒体酶促还原产生荧光 及颜色变化 可用以定量 具体测定方法是 在靶细胞孔 T 效应细胞孔 E 和实验 孔 T E 各加 alamarBlue 共育 6 24h 后用板式荧光测定仪测 530nm 发射 590nm 散 射 波长荧光强度 将 T 及 E 孔荧光均值相加后减去实验孔 T E 荧光均值 与 T 孔荧 光均值比较即可计算 CTL 对靶细胞的溶解 本法与 51Cr 释放法纺织厂较有以下特点 特异性相当但灵敏度更高 重复性好 组内及组间差异很小 使用方便 无需预先标 记靶细胞及离心和洗涤步骤 适用于大批量样品的高准确性自动测定 alamarBlue 的使 用浓度不影响细胞正常代谢及基因表达 可在无菌条件下测定后继续培养扩增细胞 有利 于对培养细胞的连续监测及深入研究 还可测定淋巴细胞增殖或化学物质的细胞毒性及 细胞凋亡 多种粘附或非粘附细胞系 细菌 真菌等可用作靶细胞 所需效应细胞数较 少 3 105 孔即可 含胎牛血清 FCS 及酚红的培养液也不干扰测定结果 7 SRB 也叫磺基罗丹明 B 是在酸性条件下可特异性地与细胞内蛋白结合的染料 SRB 染色 后不象 MTT 那样很容易变色 染色后干燥的板子可以放置较长时间 而后再用 Tris 碱液 溶解 SRB 比色测定 对结果没有影响 所以 不同时间测试的板子可以同一时间测定 即使溶解后 较长时间测定也没有明显影响 测定方法 细胞加药培养 48 小时后 取出培养板 于每孔加入 50ul 预冷的 50 三氯 醋酸 静置 5 分钟后移入 4 冰箱中静置 1 小时 取出用去离子水洗 5 遍 空气中干燥 待完全干燥后每孔加入 1 的乙酸配制的 0 4 的 SRB 100ul 染色 20 分钟后倒掉染液 用 1 乙酸洗 5 次 去除未结合的染料 空气中干燥后用 pH 10 5 的 10mmol L 的非缓冲 Tris 碱液 150ul 溶解 在平板振荡器上振荡 5 分钟 在 BioRad 酶标仪上测定各孔在 490nm 的 光吸收 本底对照板的细胞同样处理测定 OD490 有关专家透露 新的抗