【毕业学位论文】（Word原稿）串联抑制素基因免疫对小鼠生殖激素的影响-动物遗传育种与繁殖硕士论文

密级： 论文编号： 硕士 学位论文 串联 抑制素 基因免疫对小鼠生殖激素 的影响 I 摘 要 猪的抑制素 与牛、羊等家畜的抑制素具有较高的同源性，同时也与体内的多种其它蛋白质具有较高的同源性。用抑制素亚基全序列构建基因疫苗，产生的抗体可能会与体内其它同源蛋白发生 免疫 交叉反应。 (1 32)和 (100 120)区 域是抑制素的两个抗原决定簇。 经综合分析，抑制素 (1 32)既具有抑制素的免疫原性，又与 体内其它蛋白质没有同源性，它的编码序列是构建抑制素基因疫苗的理想克隆区域。用编码抑制素 (1 32)的基因与 核表达质粒重组构建抑制素基因疫苗 组质粒在 用来免疫小鼠 。 为探讨抑制素基因免疫对小鼠生殖 激素 的 影响 ，试验用 0g 、 抑制素 重组 质粒 (疫小 鼠 ，隔 15d 以相同剂量加强免疫一次 。通过 酶联免疫法 对 23 种激素 的 水平 进行 检测 ，结果 发现： 初次免疫后雌鼠血浆 度略有升高，经过 加强免疫后显著升高（ p ， 但再次加强免疫后 度没有显著的差异（ p 度 在 加强免疫与第一次免疫后变化差异显著（ p p 两次加强免疫浓度升高均有显著差异（ p 注射 大于 ，血浆中 度对注射空载体差异显著（ p 注射 于注射空载体差异不显著（ p 注射 ， 血浆中 度对注射空载体差异显著（ p 注射 注射空 载体差异不显著（ p 注射量为 浆中 度对对照组差异显著（ p 注射量 注射对照组差异不显著（ p 以上 结果表明， 抑制素基因免疫 小 鼠可 以 提高血浆 加加强免疫的次数血浆中生殖激素的水平得到显著提高。 抑制素基因免疫 小 鼠可 能 促进 小 鼠 卵泡 的发育。 为使抑制素基因疫苗产生更好的效果，应在后续试验中加强免疫次数和免疫方法等的研究。 关键词 ： 串联，抑制素，基因免疫， 生殖激素 of in in R so it is 1 32) 1 32) of So 1 32) is an 1 32) to . no in to g ， in 5d of 5d 20 . of is a in SH on 5 of of H up of no p 2 up of p It up on 5d of 2 up of no p In of of of of E2 H, up of on In to be as 录 第一章 绪论：抑制素基因免疫技术研究进展 1 制素常规免疫 1 制素常规免疫对 动物繁殖的影响 1 制素常规免疫存在的问题 3 制素基因免疫的优点 3 原性强 4 疫应答较持久，保护时间长 4 备 简便，省时省力 4 因疫苗改造方便 5 制素基因疫苗的构建 5 制素的分子特性 5 制素重组表达质粒的结构特点 5 制素基因疫苗的构建方法 6 制素基因疫苗的接种方法 7 制素基因疫苗免疫的效果 8 响抑制素基因免疫效果的因素 8 疫原 8 疫佐剂 9 疫剂量、免疫间隔及免疫次数 9 制素基因免疫的安全性 10 癌性 10 畸和毒副作用 11 受性 11 致宿主组织的病理损伤 11 制素免疫对动物繁殖力的不利影响 11 究的意义 12 第二章 串联抑制素的基因克隆与重组质粒的构建 13 料与仪器 13 要工具酶及生化试剂 13 要仪器 13 制素 32)及引物合成 14 法与步骤 14 隆单倍体 32) 14 隆单倍体 32) 17 联 32)与 32) 17 联 32)与 19 联抑制素 (1 32)基因与 组质粒的构建 21 析与讨论 23 第三章 串联抑制素基因免疫对小鼠生殖激素 的影响 25 料与仪器 25 要试剂 25 要仪器 25 验动物 25 法与步骤 25 粒的大量培养与纯化 25 素检测 26 果计算 29 果与讨论 29 疫时间的影响 29 疫剂量的影响 30 第四章 全文结论 31 联抑制素 32)的基因克隆与重组质粒的构建 31 联抑制素基因免疫对小鼠生殖激素的影响 31 参考文献 32 致 谢 41 作者简历 42 V 英文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 苄青霉素 产生氨苄抗性的 基对 补 补决定区 细胞病毒 胞毒性 T 淋巴细胞 氧核糖三磷酸 1777化乙锭 二胺四乙酸 联免疫吸附测定 卵泡激素 43 丙基硫代 B 培养基 要组织相容性复合体 黄体素 5050光度 合酶链式反应 糖核酸酶 酸电泳缓冲液 瘤坏死因子 酸 （羟甲基）氨基甲烷 L 升 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论：抑制素基因免疫技术研究进展 1 第一章 绪论： 抑制素基因免疫技术研究进展 基因免疫又叫核酸免疫或 疫，是用一定的方法将带有目的基因的表达载体转化到动物活体细胞内，其表达产物经抗原递呈激活免疫系统， 诱导机体产生特异性抗体并引起相应免疫应答的一项技术。在有关基因免疫的论文中，绝大部分是医学和兽医学中关于传染病和肿瘤防治的基因疫苗研究，如 人免疫缺陷病毒 )1,2、狂犬病 3,4、 乙肝型肝炎 5等，还有关于人类计划生育方面基因免疫的研究 6,7,8。用基因免疫的方法对家畜进行生殖调控的研究目前仅见南京农业大学动物遗传与繁殖实验室有过报道。 本文根据国内外目 前有关卵泡抑制素和基因免疫的文献，拟从抑制素常规免疫的效果及存在的问题 、抑 制素基因疫苗的优点、疫苗的构建、影响免疫效果的因素及其安全性 5 个方面综述抑制素基因免疫技术的研究进展。 制素常规免疫 抑制素是主要由 睾丸支持细胞和卵巢颗粒细胞 分泌的糖蛋白激素，主要通过反馈抑制 垂体卵泡激素 ） 的分泌 ,从而影响动物的内分泌调控 ,参与优势卵泡的选择 ,调节卵泡的发育 ,参与精子的发生 ,进而影响动物的相关生殖功能，将动物的繁殖力控制在种属特有的水平。 利用抑制素免疫动物后 ,内源性 抑制素 被抗体中和 ,血液中 有利于 配子生成 ,提高动物繁殖率。 抑制素常规免疫可使动物机体产生抑制素抗体，减小抑制素对 抑制作用，从而增加排卵率，提高繁殖力，这对抑制素免疫技术的研究与应用具有重要的理论指导意义。抑制素常规免疫的免疫原主要来自：组织液中提取、生化合成多肽 片段及重组抑制素 9,10。下 面 将从 这 3 个方面就 抑制素常规免疫对动物繁殖的影响 、抑制素免疫 存在的问题 进行 阐述。 制素常规免疫对动物繁殖的影响 然抑制素免疫对动物繁殖的影响 O1982)首先报道用天然抑制素粗提物免疫绵羊可以提 高排卵率 11,12。 报道，用100羊抗卵泡抑制素抗血清处理 母牛 后 48h、 72h、 96h 检测， 发现牛卵巢上直径分别为 477 10大卵泡大于 10著高于对照组。 96h 后大卵泡恢复到原来的水平，而小的和中等卵泡数目仍多于对照组 13,14,15。 在卵泡期进行卵泡抑制素被动免疫研究发现，母牛卵巢上大卵泡的数目显著增加，但发情后 5d 没有检测到黄体，抑制素抗血清组也没有检测到黄体，其原因是研究样本少造成的 16,17。在以往的研究中，有限的抑制素抗体成为抑制素 被动免中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论：抑制素基因免疫技术研究进展 2 疫母牛研究的制约因素。 用部分纯化的羊卵泡液免疫青年母牛，部分牛排卵数增加 1 3 个 18,19,20。 用单克隆抗体亲和层析提纯的羊卵泡抑制素，使 7 头免疫牛平均排卵数达 21。 杨利国等用猪精液抑制素主动免疫黄牛，处理的 57 头母牛中有 15 头牛产双胎，孪生率达 22,23,24。对270 头母黄牛在产后 13 个月用猪精液抑制素进行主动免疫， 34 周后进行加强免疫一次，结果发现排双卵牛的血清抗抑制素水平显著高于排单卵牛和不排卵牛的水平，且排卵数与抗抑制素抗体水平呈 正相关 (r=发育个数 32,33,34。 用不同的猪抑制素合成肽免疫美利奴山羊，结果发现一些长的抑制素合成肽 (1 32， 1 26， 7 26， 8 30)在第一次加强免疫后排卵率提高 2倍，第二次加强免疫后排卵率提高 3 5 倍，短肽的排卵反应较弱 35,36。 D分别用人工合成的人抑制素和猪抑制素 免疫母 羊，结果在繁殖季节，免疫猪抑制素提高了排卵率(降低了胚胎质量 (81 83。这是国内外首次用基因免疫的方法研究动物繁殖力调控的实验。 关于抑制素基因免疫的报道不多，报道效果也不理想。抑制素基因通过体外重组后导入动物机体，理论上可以较长时间的降低体内抑制素水平，其免疫效果应与常规免疫的效果相当，甚至更好。 响抑制素基因免疫效果的因素 关于抑制素基因免疫的文献不多，有关影响基因免疫和抑制素免疫的因素都可能影响抑制素基因免疫的效果。下面从免疫原、免疫方法、免疫佐剂、免疫剂量、免疫次数、免疫间隔等 几方面 介绍影响抑制素基因免疫效 果的因素。 疫原 抑制素基因免疫的免疫原是由抗原编码基因和真核表达载体组成的重组质粒 ， 因此影响免疫原的因素包括编码抗原蛋白的抑制素基因及表达载体的类型。 制素基因表达载体 抑制素蛋白表达的多少与基因疫苗的免疫效率有密切的关系，真核表达载体是抑制素基因疫苗的主体。细菌质粒本身无免疫原性，目前尚无抗质粒自身免疫反应的报道，这有助于质粒在体内的稳定表达。除了细菌质粒 ，细菌染色体也可改建成基因载体。 84用细菌染色体构建了一个具有复制能力、能包装缺陷病毒基因的人 工染色体 (新型载体，将抗原基因克隆入一个大肠杆菌 转染哺乳动物细胞，能复制表达抗原蛋白，产生 应，诱导免疫反应。与质粒 比， 量大，可携带复杂的较大外源基因，因此有可能发展成为新中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论：抑制素基因免疫技术研究进展 9 一代有价值的基因疫苗。 制素抗原的选择 免疫应答的本质是抗原分子中不同的抗原表位作用于多种不同的免疫细胞。但抗原表位多肽分子量小，免疫原性弱，借助于交联蛋白载体可增强免疫反应。抑制素常规免疫时都要与蛋白载体偶联或与蛋白基因等重组 (如血蓝蛋白，血清白蛋白等 )以增强抑制素的免疫原性。 O 35将合成的不同猪抑制素 亚基肽与人血清白蛋白偶联免疫美利奴羊。 5等将卵清蛋白 片段前 26 肽组成的重组抑制素免疫兔 后抗抑制素抗体滴度达 1:10000。以免疫球蛋白分子为载体，以抗原表位为基础的新型免疫分子设计结合基因免疫是疫苗研究的新方法。 86 88用 B 细胞抗原表位及一个 原表位分别克隆于 互补决定区 )和 ， 经脾直接免疫后可分别诱导特异性抗体和淋巴细胞增殖反应，且克隆于同一免疫球蛋白分子中的抗原表位相互有协同作用。将抑制素抗原决定簇基因克隆进带有免疫球蛋白基因的表达载体中可望增强免疫反应。 疫佐剂 用霍乱毒素与基因疫苗共同经鼻粘膜免疫，结果表明粘膜产生的分泌型 因免疫强 89。 行了另一种尝试，免疫效果较好。将编码 丙型肝炎病毒 ） 外壳蛋白的前 58 个氨基酸编码序列插入到 型肝炎病毒 ） 主要表面抗原的序列中，免疫小鼠后获得很高的 体滴度，而用完整外壳蛋白序列构建的基因疫苗却不能引发抗体反应 90。这种融合效应可能与增加了 淋巴细胞识别表位有关。 近来，对核酸分子的免疫效应研究发现质粒 激活巨噬细胞与 自然杀伤细胞） 细胞的作用。其中起主要作用的是以 核心的回文序列 (尤其是91,92。这种 肿瘤坏死因子 ） 和 白细胞介素 ） ，活化胞分泌 干扰素 ） 。这些细胞因子可以极大地加强 免疫应答。人工合成的或细菌来源的包含未甲基化 断也能激活 B 细胞增殖和分化，产生抗体。在细胞质粒中以 核心的一些免疫激活序列对于基因疫苗免疫活性的产生是必不可少的 93,94。 由于 剂没有免疫原性，不会引起自身免疫疾病，这克服了传统佐剂的一个重要缺点。为了很好地 激活细胞免疫，设计重组质粒时最好在目的基因的两侧插入一段以 核心的回文序列。 疫剂量、免疫间隔及免疫次数 抑制素基因免疫的剂量取决于抑制素疫苗的转染效率和抗原 递呈 的效率，而它们又受多方面中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论：抑制素基因免疫技术研究进展 10 因素的影响。如质粒的大小，免疫接种途径和方法，接种局部细胞摄取 抗原 递呈 能力等。理想的免疫剂量取决于特定的抗原和免疫方法。 对大动物 肌肉接种的免疫剂量一般为 10 100g ，基因枪的免疫剂量一般为 1g 。 95,96在小鼠体内比较了编码流感病毒核蛋白的核酸疫苗不同接种剂量 (皮内注射 )与诱发抗体关系。随着接种剂量的增加，抗体效价也逐步上升。但是当接种剂量过少 (如 1g )时，这种趋势不十分明显，而当接种剂量为 3g 时，产生的抗体量产生质的飞跃，峰值约为 1g 接种量的 6 倍。李建荣等用传染性法氏囊病病毒多聚蛋白基因 对母鸡 进行免疫，发现剂量为 200g 与 500g 产生的抗体水平最高，但两者差异不显著，对梅毒的均保护率为 10g 与 50g 仅诱导很低的中和抗体，几乎不产生保护率，因此认为免疫剂量还取决于鸡体摄取质粒 能力 97。张梦华等对汉滩病毒 S 基因免疫的结果表明 在 50g 至250g 的范围内的免疫反应不呈剂量依赖关系 98,99。 抑制素常规免疫一般间隔 20 天免疫再进行至少一次加强免疫。抑制素基因疫苗是将真核表达质粒导入机体内并使其在胞内表达抗原蛋白，理论上只需一次免疫就可使机体获得足够的免疫保护作用。实际上加强免疫可有效提高疫苗的保护作用，尤其对大动物而言，因为大动物的结缔组织比较丰富，大大影响了疫苗的转染效率。李建荣等 100 102用对传染性法氏囊病病毒多聚蛋白的基因免疫研究表明，间隔一定时间加强免疫可刺激鸡体免疫记忆诱导二次免疫应答，产生的抗体水平和保 护率明显优于一次免疫。窦骏等 103以丙型肝炎 苗免疫小鼠一次、二次、三次免疫后的抗体水平分别为 明免疫次数的增加能增强免疫反应。冯志华等 104 106对丙型肝炎病毒核心基因免疫的研究发现一次免疫的抗体水平在第 6周达到高峰，第 8 周开始下降，第 10 周消失。间隔两周免疫的抗体水平明显高于初次免疫的抗体水平。通常鼠的免疫周期为 2 4 周，免疫 2 3 次，牛的免疫周期为 1 个月以上。 107 110最早于 1993 年给牛连续 5 次注射 粒 次剂量为 果诱导了部分保护。 12用 苗间隔 2 个月三次免疫产生的抗体不及间隔 3 周二次耳部皮下注射 500g 产生的抗体滴度高。 制素基因免疫的安全性 抑制素基因免疫作为一种新型免疫方法，其应用前景不可估量。随着基因免疫的不断扩展，基因免疫的安全性问题也日益受到广泛的关注。安全性的主要问题包括 ： (1)抑制素基因是否会导致宿主组织的病理损伤； (2)是否会产生致畸和毒性作用； (3)能否产生免疫耐受性 ； (4)质粒能否整合到宿主染色体 上且能否遗传到下一代。 癌性 质粒 否可能整合到受体基因组中。因为外源基因的整合可能导致原癌基因激活或抑癌基因失活，也可能导致某个功能基因失活。整合有三类：随机插入、同源重组和逆转录病毒插中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论：抑制素基因免疫技术研究进展 11 入。后两者在质粒设计时可以避免。因而，基因疫苗最可能以随机整合为主。据估计，随机整合机率为万分之一。应用 交发现，进入肌肉内的质粒很快被清除到检测不到的程度 ： 用术跟踪，质粒在肌肉内持续存在一个月以上。如此微量的质粒存留，其整合机率微乎其微。 畸和毒副作用 抑制素基因 疫苗可能对宿主产生的致畸作用主要包括对宿主后代的胚胎毒性、胎儿出生前后的毒性、一般生殖毒性以及繁殖力的影响，抑制素基因免疫是否会对宿主自身的繁殖性能产生毒副作用。己进行的实验表明，抑制素基因免疫的大鼠和小鼠发情周期正常，产后仔鼠无畸形，初生重与对照组无显著差异。 受性 基因疫苗接种后表达少量蛋白，并持续较长时间。因而诱导免疫耐受的问题令人关注。在成年动物中，目前尚未观察到由于接种基因疫苗而诱发的特异性耐受的例子。相反，有人利用转 型肝炎病毒表面抗原） 基因小鼠进行 疫发现，小鼠己经建立的对 特异性耐受状态在接种编码 质粒后被破坏，使小鼠产生抗特异性免疫。 致宿主组织的病理损伤 抑制素基因在宿主体内表达，导致宿主产生抑制素抗体并引起免疫反应。至今未从被免疫的宿主体内观察到由于基因免疫导致的宿主组织产生临床化学和血液学上的副作用，也未曾发现由于基因免疫导致宿主的任何器官损伤和系统的毒副作用。由于在免疫反应的过程中对宿主体内的组织是否没有影响以及对宿主体内各组织的作用机理尚未完全摸清， 基因免疫导致宿主组织产生病变的可能性始终存在。 制素免疫对动物繁殖力的不利影响 虽然很多实验在免疫后可提高母畜的排卵率，提高双胎或多胎率，但 113 115人用抑制素 N 端肽 免疫处女羊，得出结论认为 ， 免疫作用降低了绵羊的繁殖力，对抑制素免疫的作用提出了异议。 人用猪亚单位 N 端合成肽片段免疫处女牛 ， 显示免疫显著破坏了牛机体控制排卵的机制，但对繁殖力没有损害 116 120。还有其他科学家对此作了研究 ， 结论也有较大差异。如果从长远一点的利益看，一次免疫到底对以后母畜 繁殖机能有多大影响，产仔数的增加是中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论：抑制素基因免疫技术研究进展 12 否会影响初生重、初生仔畜的哺乳、生长及其发育，仍是个问题。 究的意义 繁殖力是家畜重要的经济性状，用免疫学方法调控家畜繁殖力已成为生殖免疫的一个重要部分。其中，用抑制素主动或被动免疫的方法改变家畜繁殖力受到畜牧兽医界的广泛重视，并在牛、羊等大中家畜中取得了较为理想的结果。生殖免疫研究的总目标是 通过 免疫应答对生殖过程的调节，最终达到动物多胎多产的目的。 用免疫调控的方法提高家畜的繁殖力主要是基于以下的理论基础。家畜的繁殖力主要由下丘脑一垂体一性腺轴精确调控。繁殖力 之以能保持在种属特有的水平，在排卵数控制的环节上，主要是促进排卵的激素与相应抑制排卵的激素保持在恰当的生理水平。当用免疫中和的方法使抑制排卵的激素水平降低，打破这种生理平衡，可能使家畜的排卵率增加，如果其它条件适合，则可以由此增加家畜的繁殖力。例如，中国农业科学院兰州畜牧 与兽药 研究所研制出的“双羔素”可以使 25%左右的绵羊产双羔。 抑制素由卵巢颗细胞合成和分泌后，主要通过反馈抑制垂体促卵泡素 ( 的合成和分泌，同时抑制素在卵巢局部可能 存在旁分泌或自分泌作用，调节卵泡的生长发育，最终影响家畜的排卵率和 产仔数。抑制素在哺乳动物中具有较高的同源性，抗人抑制素抗体能有效地中和牛 、 羊等动物内源性抑制素，从而去除抑制素对垂体分泌 抑制作用，间接地提高内源性 平，促进多个卵泡的生长发育成熟。用纯化的牛卵泡抑制素、合成的抑制素亚基和亚基合成肽片段主动免疫牛、绵羊等均可以增加 母 畜的 平和排卵率 (121； 122)。 抑制素常规免疫虽然能提高家畜的繁殖力，但目前抑制素的来源面临困境 ，限制了抑制素免疫技术的发展 。 基因免疫的方法是从 1990 年开始探索的全新免疫方法，至今仅有 15 年历史。主要是将目的基因与真核表达质粒重组，目的基因在体内表达后，通过抗原递呈激活免疫系统，产生抗体。目前主要是将病原微生物基因与真核表达载体重组后免疫动物，探索用于疾病控制。 抑制素基因免疫是 将抑制素基因与真核表达载体重组后免疫家畜，使抑制素在体内表达 激活免疫系统，产生抑制素抗体，中和内源性抑制素，提高动物的排卵率，最终提高动物的产仔率。 用 牛卵泡抑制素 片段 (8 20)、 (153 167)、 (8 30)、 (63 72)、 (107 122)主动免疫或被动免疫 动物，各抗原肽免疫后的结果不 一 致，只有抑制素 (8 20)和抑制素 (107 122)两个片段具有免疫效果（ et 1995123； 杨灿锋 ， 20