【毕业学位论文】（Word原稿）马铃薯四倍体栽培种茎段组织的EMS诱变研究蔬菜学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士学位论文 马铃薯四倍体栽培种茎段组织 的 变研究 on in on in I 摘 要 诱变育种是解决育种资源不足的一种有效的育种技术。化学诱变剂 用于活或失活基因功能，经过筛选和鉴定，能够创造或改良作物的性状。这种方法在许多作物上已有运用并育成品种。由于多倍体染色体间更为复杂的互作，多倍体作物的诱变效率尚不确定 。本研究通过诱变剂 理马铃薯四倍体栽培种的茎段组织，探讨 马铃薯四倍体（ 4X）的诱变效果。 试验中，以马铃薯四倍体栽培种（ 管苗带顶芽、腋芽、侧隐芽的茎段组织和愈伤化茎段组织为试验材料，研究了 理的诱变效应，对处理后代的试管生长和大棚生长进行了跟踪观察及群体分析。试验结果如下： 1. 浓度 1%的 液对中薯 2 号马铃薯栽培种茎段组织具有诱变效应。诱变剂 够进入茎段组织中，使侧隐芽及周围组织呈现白化，数天后从白化组织中再生出绿色小芽。使侧腋芽呈现部分白化，腋芽经 历一个生长减慢或停滞的时期，在 20 50d 内逐步恢复生长速度。不同品种对诱变剂的耐受能力不同，诱变后对处理的反应也不同。经 1% 察到的如下变异：植株矮化、花器官变异、叶形变异、茎色变异及薯色变异。 2. 对无性系带侧隐芽和侧腋芽茎段的诱变后代群体的生长发育状况和形态色泽的观察以及块茎主要成分的测试统计分析表明：经诱变的 4 个群体与同等条件下培养的对照在生长发育状况指标 株高、茎粗、结薯数和花蕾上存在不同程度的差异；植株的茎、叶形态和色泽也有一定比例的变异。其中叶形变异在棚栽二代表现出可遗传的 特性，表明 时，虽然诱变后代块茎干物重和淀粉含量并未出现超常的变异范围，但干物质中还原糖含量表现出了 3 倍于正常群体的变异系数和较大的变幅，说明 马铃薯四倍体诱变还原糖含量方面具有较大的育种潜力。 a) 带侧隐芽和侧腋芽茎段的诱变后代两次棚栽试验中都观察到了茎色变异性状，可以作为辅助性状进行观察筛选；茎形、叶色、花蕾性状的变化可能是性状对应结构基因的改变。由于这些性状表现同时发生相关的变化，也可能反应植株的成熟期控制基因的变化，可以用作品种成熟期变异的指示性状。 b) 生长 中遇 温天气条件时，对照群体中 植株发生红斑并不能正常生长， 株全株坏死，叶形变异群体中 28%发生少量红斑，无因寒冷而死亡的个体，表现出了良好的抗寒性。该结果表明 时植株的形态变异可能与其他变异相关联，有望成为潜在的指示性状。 综上所述，本研究证实了 用于 马铃薯四倍体 栽培种离体茎段组织，能够产生明显的诱变效果，具有一定的育种潜力。同时，本研究表明， 变是一种马铃薯育种手段的有效补充。 关键词 马铃薯 组 织培养 变 突变体筛选 is an to in of is is of NA of of of MS in is to be to n in is In we MS to y . , MS in in of % h. as in a B5 to in MS of t in of of nt 1. We in MS a to in 0 of in 0% of 0 of 2. In of s of of of of in of so in nd in of a 3 a) In nd in in a 34C of of of g in 8% of of b) We MS is to in a in in a to a to in be as a 录 第一章 文献综述 1 物诱变研究进展 1 1 化学诱变剂的诱变谱 3 体细胞无性系变异 3 突 变体的筛选 4 嵌合体及其纯化 5 物诱变在马铃薯育种上的应用 6 项研究的意义和目的 7 第二章 研究材料与方法 8 究材料 8 研究方法 9 第三章 研究结果与讨论 13 段胚性愈伤组织诱导 13 同品种对茎段胚 性愈伤组织 的反应 13 株的不同部位愈伤诱导效果的差异 13 段的不同部位对胚性愈伤组织形成的影响 13 代次数对愈伤组织诱导和再生植株的影响 14 16 处理效果 16 理不同组织的诱变效应 16 理不同品种的诱变效应 16 理对植株植物学形态的影响 17 理后代的田间表现 21 株矮化 21 官颜色变异 22 器官形态变异 23 异植株的耐低温表现 23 变第 6 代（ 栽试验结果与分析 26 生长量变异状况分析 26 茎主要成分变异状况分析 26 植株外观及生育性状变异状况分析 28 遗传因素和栽培因子对植株生长、结薯状况的影响 29 尖染色 31 第四章 结论与讨论 32 参考文献 35 致谢 40 作者简历 41 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 1 第一章 绪 论 变研究进展 1 诱变作用机理 损伤及生物修复系统的功能 自然条件下， 伤和发生复制差错的频率都是很高的。 1989)对鼠肝脏因氧化作用引起的 伤作了统计，核基因组每 130， 000 1 个损伤，线粒体 每 8000一个碱基损伤。 制的错误包括转座、倒位、移码和丢失。 988)报道 “ 制错误频率大约是 10每一个复制的基因中会出现一个错误”。而个体突变的频率仅为 1010因是这些错误“大部分被各种 复系统在复制中或复制后修复”。因而，修复系统的高效率是物种维持遗传稳定的决定因素。 991)曾对高等植物除紫外修复以外的 复提 出了疑问，原因是当时关于修复系统的研究都集中在关于微生物、酵母和拟南芥上，大多数 复系统的研究都基于低等生物和少数模式植物。由近年来的研究看来，修复系统的作用是明显的，只不过它的功能并不是精确无误的。 et 1988）年提出，实验表明细菌可以选择性发生有利于存活的突变。 为在选择压力下为获得适应性作的基因水平的突变似乎是被允许的，有选择性压力比中性环境更多获得基因的突变。突变形成只出现在包含允许错误修复的 合酶 编码基因 的克隆里，筛选条件既可以刺 激 变体的反转突变 也可以促使野生型基因发生适应性突变。 E.， C（ 1994）用 变大肠杆菌报道了 赖型的突变。在 白过量表达的细胞中富含 )和另一基因 )突变率增高。他们的研究也表明导产生的突变位点在细胞饥饿时被 化的重组修复方式修复。正常情况下 化的重组修复方式是避免复制错误发生的途径，但在代谢活跃的细胞里，由于有 译合成的 合酶 3 全酶复合体的出现，也会以易产生差错的修复途经进行修复。以上研究不同程度地表明生物体为在逆境中求生是可以产生适应性突变的。 2002）等人对阻遏蛋白 码基因进行诱变，发现沙门氏菌中 效突变体是致死突变，也就是说 效突变体不是突变效应的增效基因。这一结果和大肠杆菌中一样。进一步研究表明： 特殊修复方中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 2 式的作用因子。能造成 伤或复制受抑制的逆境会引发一系列称为应急反应（ 复杂的 诱导修复效应。在不利环境中当突变有利于生物的生存的情况下，细胞为避免死亡而启动这项特殊的求生功能，包括 伤修复、诱变效应、细胞分裂的抑制以及溶原性细菌释放噬菌体等。 统有 复和导致变异两条支路，具有双重功效。该反应由 白和 遏蛋白相互作用引起。 白是 应系统的发动因子，单链 在时， 白被激活促进 遏蛋白水解，使 应的一系列基因得到表达，其中包括紫外线损伤的修复基因 别编码切除酶的亚基 )以及 因本身，与诱变作用有关的基因 细胞分裂有关的基因 等。 从突变的后果看，并非所有的碱基改变都能影响基因的功能和表型。突变可能的后果有三个，即基因功能的丢失、新功能的获得和对基因表达完全没有影响，分别由编码区的突变和非编码区的突变引发。基因编码区的突变可能会引起单个碱基的替换、缺失等造成合成的蛋白质类型改变，因而造成基因功能的丢失或新功能的获得；或者因移码引起阅读框改变合成了另一种蛋白质或提前终止转录转译而不合成有功能蛋白，也能造成基因功能改变或尚失 。而非编码区的突变是否影响基因功能就有很强的选择性，以 读框上游 35 非保守区发生碱基突变并不影响下游基因的启动转录，但 50 和 40区， 的突变就影响很大，可以引起基因功能的变化甚至表型变化。起始位点上，甚至单独一个碱基的突变都造成基因表达失活，产生表型变异。 诱变剂 用的机理 文名为甲基磺酸乙酯。无色液体，分子量 124，分子式 中溶解度为 8%， 件下在水中半衰期 20时是 93h， 30时 26h。 烷化剂的一种。烷化剂通常带有 1 个或多个活性烷基 ,此基团能够转移到其它电子密度高的分子上去 ,使碱基许多位置上增加了烷基 ,从而在多方面改变氢键的能力。证明是最为有效而且负面影响小的诱变剂。与其他烷化诱变剂类似是通过与核苷酸中的磷酸、嘌呤和嘧啶等分子直接反应来诱发突变。 发的突变主要通过两个步骤来完成 , 首先鸟嘌呤的 置被烷基化 , 成为一个带正电荷的季铵基团 ,从而发生两种遗传效应 :一是烷化的鸟嘌呤与胸腺嘧啶配对 ,代替胞嘧啶 ,发生转换型的突变 ;二是由于鸟嘌呤的 糖苷键断裂造成脱嘌而后在 烷基化鸟嘌呤与胸腺嘧啶配对 ,导致碱基替换 , 即 G C 变为 A T。诱变剂也可与核苷结构的磷酸反应 , 形成酯类而将核苷酸从磷酸与糖分子之间切断 , 产生染色体的缺失。这些 构上的变化都可能促使不表达的基因或区段被激活，而表现出被掩盖的性状。 学诱变产生点突变的频率较高 ,而染色体畸变相对较少 ,可以对作物的某一种特殊性状进行改良。与其它诱变剂相比 ,变后产生的突变频率高 ,且多为显性突变体 ,易于突变体的筛选。是目前运用最中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 3 广泛也是公认最为有效的 化学诱变剂的诱变谱 人们观察到的突变现象中，雄性不育的突变成为观察到较多的性状，原因是两种不同类型的不育都在诱变谱的范围里。细胞质不育是报道最早的突变类型之一。而在 2003 年 et 四倍体棉花诱发突变后代中分离出，分离比接近 1： 1 的核基因不育型个体，证实核不育也在诱变谱中。 生产中需要的矮化类型，也在诱变谱内，而且已证明是单基因控制的性状；此外，观赏植物需要的突变类型集中在花型和叶型上也是诱变最敏感，易观察到的性状。叶片的蜡质、有毛或无毛性状有非常多的报道。根 据笔者的试验，有关叶绿素的突变如黄化和白化也是高频发生的诱变性状。其他报道较多的突变性状还有抗病性及一些产量、品质相关的性状如穗粒数、糖含量等。 不同的诱变剂有不同的诱变谱。谷爱秋等（ 1994）采用三种烷化试剂 酸二乙脂），和 烯亚胺）对黑龙江地区的大豆推广品种进行诱变，得到形态变异频率大致相同，而早熟突变频率差异很大，丰产性状突变率以 最佳，并从中选育出高抗、优质、高产的大豆新品种，以 变处理后也获得了优异的新品种。 体细胞无性系变异 体细胞无性系变异的特点 体细胞无性系变异已被认为是改良植物性状的一种潜在的技术手段，并已运用于马铃薯品种的改良中（ 992）。在组织培养中人们发现经过组培过程的再生植株存在可以观察到表现型发生变异的个体，这种现象称为体细胞无性系变异。进一步的研究证明：这些变化有的是与细胞核质内的基因突变、基因重排、基因扩增和转座基因有关的（ 是可遗传的变异。诱发的因素往往是培养基中的激素类物质（ J， 1981； F 和 K， 1986）及高浓度的盐类物质（ 1986）。普遍的研究和生产实践证实，大量的 染色体变异发生在愈伤组织诱导初期，利用含有叶、茎和芽基的幼嫩组织，则可保持正常的 体细胞无性系用于诱变的优势 发生在愈伤组织诱导初期的 染色体变异，对获得愈伤组织再生植株突变体有利。愈伤组织的诱导相对容易，利用这条途径获得体细胞无性系变异体具有简便、有效的优势。 体细胞无性系的特点是繁殖快速，而含芽的茎叶外植体往往具有正常的 以保持品种稳定的遗传特性，因此在马铃薯脱毒苗工厂化生产中具有广泛而成功的运用。化学 诱变试剂作用于含芽的试管苗茎叶外植体，诱变后能快速地扩大筛选群体，快速稀释诱变剂在植株体内的残留量以达到尽快让遗传物质稳中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 4 定的目的，一旦发现突变体也能快速扩繁、快速检验，继代中可以保留所有的细胞，也有利于将突变的非生长点细胞扩繁并最终纯化筛选出来。将化学试剂诱变建立在茎叶外植体的组织培养平台上，具有操作便捷、变异诱因单一便于分析、筛选效率高等优点，是一条新的值得尝试的育种途径。 突 变体的筛选 诱变是否成功很大程度取决于育种者的目标是什么。筛选不同的性状的难易不同，而不同的性状有各自不同的遗传力 。遗传力高的性状稳定性好，不容易受到环境因素的影响，反之亦然。因此，选择遗传力高的性状比遗传力低的性状容易成功。单基因控制的性状更易筛选、观察，如花色、叶形态、叶表面蜡质、绒毛、矮化、核雄性不育以及一些抗病、抗生素抗性性状等等都是遗传力很高的表现型。这些性状比多基因性状容易被发现、确定和选择。 而产量性状的考察对象包括种子、叶子、花朵、果实、嫩茎、块茎、块根等等，涉及到株形、产量、蛋白、淀粉、糖、纤维含量、可溶性固形物含量、次生代谢产物及抗病性等。相应成分的检测，经典的方法是在油菜油酸上采用的“半子叶法”， 即取种子中一半的子叶用于气相色谱分析微量成分，种子其余部分仍正常生长筛选其他性状。 筛选方法分为常规方法和特殊方法。常规方法指对作物突变后代进行外观性状、丰产性状、品质性状、育性和抗逆、抗病性状的观察、检测及评价，从中筛选出具有源材料不具备的性状或某一数量性状表达量显著高于源材料的突变体。 非常规方法往往是在植物诱变的不稳定期施加额外的选择压，如在微生物诱变时 ,在培养基中添加不利生长的成分以协迫细胞发生有利存活的变异。 1 筛选方案的选择 对于严格自交的作物 1979）提供 了四个确定 群体大小的可选择的方案：）每个 植株只收获一粒种子； 2）每个 植株获取一个可繁殖器官如果实、豆荚、穗等；）每个 植株收取多个可繁殖器官果实、豆荚、穗 ；）把从 植株不同部位收取的种子混在一起 。 对于一些遗传力低的复杂性状， 1975）对燕麦使用间接筛选的方法，通过计算颗粒与生长量比值作为丰产指数，进行筛选。这个方法化繁为简，能高效地筛选表现好的个体。缺点是可能会漏选个别低生长量但高产的突变体。 2 起始筛选世代的确定 受到诱变处理的材料 习惯上看作是 此产生种子萌发的植株是 性繁殖材料，相应称为 考虑到诱变后细胞和染色体极不稳定的结构和修复损伤的需要，同时诱变剂的后效作用也需要通过世代传递来消除，通常突变体的筛选从 开始。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 5 选择产量性状之类多基因控制的性状，有人认为筛选工作必须在突变表型稳定的 以后才能开始进行。应用数量遗传学计算可知，由于种子诱变中出现的突变基因中最初的几代中会因减数分裂而经历较高的丢失率，其概率函数为（ Z） Z 1。在第一代突变基因绝迹率为，令 （ 0） 0 1 二代及其后世代为 （ 0）（ 就是说种子诱变的突变基因必须在 7 代以后才能相对稳定，因此严格的育种者对田间突变体的选择往往从第 7 代开始。 对于抗病性，冷的忍受性，固氮特性可以在 苗期进行筛选。 种子本身是个基因型复合体。种皮来自母细胞，胚和胚乳是新的基因型。如果突变发生在种皮上，必须在 能进行筛选 ，如果突变发生在胚乳上，就会随着胚的萌发和胚乳的程序性死亡而变成无效突变。 3 筛选规模的确定 理论上，规 模越大越有利突变体的筛出，但育种者对材料的处理能力是有限的，因此筛选的规模常常视育种者的处理能力而定。种子突变体筛选时常以十万为数量的最小值。 而花粉诱变时处理群体较小。 1978）和 1991）等认为：花粉处理平均每个位点单个基因的隐性和显性突变率可达 1010者以上。因此一套 30005000 的 体应该包括所有隐性突变，可以筛选到所需要的质量性状突变体。 嵌合体及其纯化 嵌合体在多细胞组织自发或诱导突变中都很常见，是由于突变细胞在组织 中处于次要位置造成的，但仍然很有用的。许多无性繁殖的植物如菊、康乃馨等的嵌合体足够稳定，可以直接用于生产。而大多数的嵌合体不够稳定，受周围正常细胞和 复系统的影响和作用，常发生反向突变（“ 而恢复正常的表达状态。要使嵌合体纯化，以得到稳定可用的突变，对于可以进行种子繁殖的植物，长期的田间观察和选择是必要的，也是可行的。对于可以快速大量繁殖的试管繁殖材料，使每一个芽都大量繁殖并观察其后代有利于发现和纯化嵌合体。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 6 1 2 植物诱变在马铃薯育种上的应用 马铃薯（ 2n=4X=48），茄科茄属中能形成块茎的栽培种植物。是世界第四大粮食作物 ,是我国产业调整的重要发展对象。 马铃薯原产南美洲安第斯山 (随着哥伦布探险美洲大陆而传播到世界各国。由于资源引入来源狭窄，加之 19 世纪中期爆发的大面积颠覆性欧洲马铃薯晚疫病 (影响，造成了现有品种及其育种材料基因狭窄 (1974)的特点。常规杂交育种是目前使用最多的形成品种最多的育种方法，我国最近 50 多年来通过引进资源和杂交育种方法育成 100 多个 品种，其中的 30 个品种占全国每年种植面积的 90%。 1974 年作的共祖率分析表明，美国现有马铃薯栽培种间普遍存在亲缘关系。由于我国马铃薯系近代由欧美引进，存在更为严重的类似问题，因此狭窄的基因背景，已使得杂交育种的优势难以体现。 人工诱变用于植物由来已久，目前仍以代谢生理、发育生理、抗性、疫苗等研究性的工作为主。直接用于诱变育种方面较少，但也有成功运用，如在棉花、小麦、油菜、和一些花卉上都形成了品种。限制人工诱变方法直接用于育种的因子主要是基因型纯化、固定上的困难、后代筛选周期过 长（稳定的种子繁殖突变体需经 7 代选择）和分子检测中不能确定突变方向以及品种专利等问题。而无性繁殖植物无需经历减数分裂繁殖后代，具有突变相对易稳定易保存的特点，筛选和观察可以从无性二代开始，因而用于诱变具有特有的优越性。以无性繁殖方式栽培的荷兰鲜花，其栽培品种中约有 70%是突变体后代繁殖。此外，无性繁殖植物分子鉴定时，由于建立的是纯的近等基因系，分子作图没有假阳性标记，得到的标记能真实反应突变的单基因或控制同一性状的多基因的多态性。这一点也有利于突变筛选或进一步的机理研究。因此在以无性繁殖为主要繁殖方式的马铃 薯育种中使用人工诱变方式可能取得高于种子繁殖作物的育种效率。 体细胞的自然突变选种国内外都有较为典型的例子。自然突变中利用得最多的是芽变。芽变是一种对已育成品种的不良性状自发进行修饰产生稳定的可遗传的突变。芽突变具有较好的稳定性。如美国的马铃薯品种“麻皮布尔斑克”就是自然芽突变选出的品种，在美国已育成 100 多年，至今仍在生产上广泛使用。我国的“坝丰收”等马铃薯品种也来源于自然芽突变并运用多年。但自然芽变率是非常低的，在高等植物中仅为 100且得到的突变体性状不可预测，这就大大制约了天然芽变的有 效利用。利用组织培养方式，可以在较小的空间内得到较大的群体，并能在一个生长季多次对易感组织或细胞进行诱变，从而大大增加诱变的次数和获得变异的概率；组织培养诱变比纯理化诱变的突变率大约高一倍，因此可以大大增加诱变的效率。对无性繁殖作物而言，一旦获得突变材料，可以立即快繁扩大群体或加以保存，最大限度地稳定住好的突变材料。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 7 项研究的意义和目的 作者所在的贵州省马铃薯种植面积自 1999 年以来以较快的速度逐年增加，目前已近 800 万亩，国内排名第二。但育种工作起步较晚，缺乏相应的资源和研究背景，自主育成的 品种极少。 据 供数据表明：现存马铃薯资源中，茄属有 235 个结块茎的种，但只有为数不多的几个可与马铃薯栽培种（ 亲缘关系、互交可育。现有栽培种多为四倍体，野生种多为二倍体，野生资源中的抗逆性等优异性状因倍性原因不能直接利用，需要分解育种方法，如 2N 配子途径才能引入新的基因型对现有栽培种进行改良。尽管 2N 配子为野生种的利用开辟了新的途径，但贵州省缺乏相应的研究基础，短期较难上马；转基因育种方式在贵州省还处在起步阶段，不能较快直接运用。而从国内外的研究现状来看，由于高等植物的基因载 体装载能力限制着许多基因的转移效率，高等植物转基因的稳定性和基因沉默等问题一直困扰着转基因研究的迅速发展，转基因目前未必是解决问题的理想途径。 基于贵州省马铃薯育种的现状，接合贵州省农业科研的现有条件，针对生产中存在品种问题，我们选择在无性繁殖的四倍体马铃薯上进行体细胞诱变，通过研究作用于 构的诱变剂 四倍体马铃薯茎段等组织的有效性，证实 索对诱变后继代 4 次并经 2 次棚栽的个体或群体进行株系选择的可行性，确定可用于筛选突变的性状，提高人工诱变的效率、建 立相对完整的诱变体系，为贵州省马铃薯产业化发展提供优良品种进行育种途径的探索。 中国农业科学院硕士学位论文 第二章 研究材料与方法 8 第二章 研究材料与方法 愈伤组织诱导试验： 选用贵州省农业科学院生物技术所建立的“米拉”、“克新 4 号”和“夏坡蒂” 3 个马铃薯品种的脱毒试管苗，及中国农业科学院蔬菜花卉研究所提供的 “中薯 2 号”马铃薯脱毒试管苗。取无腋芽的试管苗茎段，于 5+2,+食用白糖 2 +琼脂 养基上诱导，待茎段略微膨胀，两端愈伤化时用于诱变处理。 变试验： 选用中国农业科学院蔬菜花卉研究所提供的“中薯 2 号”和“夏坡蒂”马铃薯脱毒试管苗。将试管苗切成约 1、带有 1 2 个腋芽的茎段，在150角瓶内培养扩繁，继代 3 次，待试管苗扩繁至约 400 株，苗长至 6 8 片叶时切取茎段用于诱变处理及对照设置。试管苗扩繁条件：培养基为 2食用白糖 脂， 养温度 25，光照 13h/d，光强 2000代时间约 46 周。 再生苗移栽、大棚观察选用“中薯 2 号”诱变后代无性系。大棚栽培条件：厢面宽 质壤土，实行雾化喷灌补充水 、适量肥及少量药。 试验时间地点 试验于 2004 年 7 月至 2006 年 2 月分别在中国农业科学院花卉蔬菜研究所和贵州省生物技术研究所完成。试验材料准备和 变工作在中国农业科学院花卉蔬菜研究所茄科实验室进行；诱变后代的试管观察及棚栽观察试实验在贵州省生物技术研究所进行。 中国农业科学院硕士学位论文 第二章 研究材料与方法 9 无性系建立 取 健 康 试 管 薯 的 饱 满 芽 ， 经 消 毒 处 理 后 在 解 剖 镜 下 剥 去 外 层 叶 片 ， 切 完整芽原基，置于 L L 3蔗糖 脂培 养基上，约 50d 后形成新的植株，继代 35 次，取茎段形成愈伤组织的试验，尽量使用单株后代以消除基因型和营养状况不同对愈伤形成的影响。 茎段愈伤组织诱导 取茎顶部到基部不带芽茎段，切成 1，区分为茎上部、茎中部和茎下部三个部位，分别接种到含 L 2， 4L 3蔗糖 脂培养基的培养瓶中，观察生长状况。每个品种每次用于试验的茎切段数量多于 100段，重复 7 次，在茎切段培养 35d 时进行生长状况统计。 继代次数对愈伤诱导及再生植株变异率的影响 切取愈伤再生植株单芽茎段扦插至不含激素的 养基，正常转接两次后，以茎段同源的单芽茎扦插植株作对照，对分别由新建材料和多次继代材料诱导的愈伤再生植株进行生长速度、叶片形状、分枝状况、生根情况的统计，比对差异计算再生植株的试管苗变异率。 用 1%（ v： v）的 液处理愈伤化茎段、带顶芽茎段、带侧隐芽茎段和侧腋芽（芽已萌发）茎段各 100 个。以未处理茎段（ 助溶剂水溶液（ 对照。 愈 伤 化 茎 段 处 理 ： 处 理 液 滴 加 在 已 略 微 膨 胀 的 脱 分 化 的 茎 段 上 ， 转 入,T 1用白糖 2 +琼脂 养基上诱导植株再生，观察再生植株变化。 带芽茎段处理： 将带顶芽、侧隐芽和侧腋芽茎段浸泡于处理液 4 h，用无菌水清洗 3 4 次 ,转入 2食用白糖 脂培养基上生长观察。 再生苗扩繁移栽 理后的再生试管苗，在 2食用白糖 脂培养基上扩繁 4代，经炼苗后移栽于 40 目防虫网棚内，继续观察 2 代。 棚栽试验： 大棚内苗床，将基质整平、浇透水，将长度约 5 带根试管苗，洗净培养基，移栽至苗床上，株行距为 5 10 取小薯后，将小薯按大中国农业科学院硕士学位论文 第二章 研究材料与方法 10 小分级后再次播种在大棚苗床上，株行距为 10 12 棚内厢面宽 、肥、农药等按常规方法管理。 对经诱变处理的材料进行四代试管扩繁、观察和两代大棚栽培观察。 诱变后观察 试管苗观察：各处理分别于处理后 5、 20、 50 d，观察记载试管苗生长速度、株型、茎、叶等发育的变化特征。 网室栽培苗及薯块观察：进行株高、茎粗、茎形、茎色、叶形、叶色、薯色、块茎中淀粉含量、还原糖含量及块茎干物重的观察和测定。 薯块主要成分测定 将鲜薯切薄片称重、置于 45温箱内烘干。转至玻璃干燥器中静置 12，再次称重，差减得到干物质重量，用于计算干物质含量。之后将干燥的薯片放入 粉末溶解于酒精后，分别用酒精浸提 砷钼酸比色法和酸水解酮还原碘量法滴定测定块茎干物质中的还原糖和淀粉含量。 诱变第 6 代（ 栽试验设计 为明确 变第 6 代（ 系的生长发育及块茎主要成分变异情况，试验采用随机区组设计，针对不同变量分别用变异系数、百分数、平均值 和方差分析等方法对数据进行分析。 对株高、茎粗、结薯数、块茎干物重、块茎淀粉含量、还原糖含量等不连续变量，进行平均值、变异系数和变异范围的计算；对茎形、茎色、分枝数、叶色、花蕾等不连续变量分别作分级处理，进行百分数计算比较其变异程度；采用方差分析的方法对遗传因素和栽培中主要影响因子的生长性状变异程度作估测。 数据调查时期 株棚内生长 60查株高、茎粗、茎形、茎色、分枝数、叶色、花蕾有无及结薯数； 65降温引起的红色坏死斑点进行分级统计；块茎收获后 30d 用于主要成 分测定。 生长量和块茎主要成分变异观察 试验设两组对照，一组与诱变的无性系源自同一株试管苗，在同样的培养环境下，经相同继代次数繁殖而来，用于消除环境和培养条件的影响；另一组来源相同的对照，由另一实验室在相同培养环境下繁殖而来，用于增加对照的变异系数和范围，消除由于人为操作造成的影响。随机抽取 200 个植株，记录其株高、茎粗、结薯数，测定块茎的主要成分干物重、淀粉和还原糖在干物质中的含量，用于计算平均值、变异系数和变异范围。 在全部诱变后代中，完全随机抽取 604 个植株，记录其株高、茎粗、结 薯数，中国农业科学院硕士学位论文 第二章 研究材料与方法 11 测定块茎的主要成分干物重、淀粉和还原糖在干物质中的含量，用于计算平均值、变异系数和变异范围。 植株外观及生物学性状变异状况观察 设三组对照 别对应贵州省田间种植的中薯 栽后代；与诱变的无性系源自同一株试管苗，在同样的培养环境下，经相同继代次数繁殖的棚栽后代；另一实验室