【毕业学位论文】（Word原稿）水稻第6染色体短臂硅含量QTL的分解和色素原基因C的精细定位生物化学与分子生物学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士学位论文 水稻第 6 染色体短臂硅含量 分解 和色素原基因 C 的精细定位 on rm on rm I 摘 要 水稻是世界上最重要的粮食作物之一，具有高含量的硅是它的一个重要特征。水稻各部分色泽由 统控制，其中色素原 基因 C 是产生色素的基础基因。 前期研究利用珍汕 97B/密阳 46 重组自交系群体，在第 6 染色体短臂检测到控制水稻硅含量研究利用在目的区间 合、背景纯合的一个 株，即剩余杂合体，这种材料相当于近等基因系材料配对杂交产生的 交得到由 221 个株系组成的 体，定位水稻硅含量 时 针对 水稻第 6 染色体短臂色素原基因 C 的可能位置，从该 体中 筛选到在 C 基因 周围区间 呈不同基因型组合的 7 个剩余杂合体（ 收获种子建立 群体，进行 C 基因的精细定位。 主要结果 如下： 2005 年夏在浙江省富阳基地种植 221 个 系，分株系测定 体茎秆和剑叶的硅含量。应用覆盖目标区间 15 个 记组成的遗传图谱，检测到 3 个控制茎秆硅含量 2 个控制剑叶硅含量 3 个控制茎秆硅含量的 别位于 间，最高 分别为 别为 3.0 18.9 59.8 性效应分别为 显性效应分别为 显性度分别为 献率分别为 2 个控制剑叶硅含量的 别位于 间，最高 别为 3.0 59.3 性效应分别为 显性效应分别为 显性度分别为 献率分别为 2006 年春在海南省陵水基地种植 7 套 生的 体，通过对各个群体颜色表现和原因型的比较，将 C 基因定位于微卫星标记 间。在该基础上， 应用两个分离群体共 1279 个样本，经标记检测和连锁分析，进一步将 C 基因定位于 遗传距离分别为 0.7 0.4 后，应用区间内的另外 6 个微卫星标记和 1 个源于 C 基因 候选基因 标记 ，检测 在 因 间内发生了重组的 22 个个体， 将 C 基因定位于一个大小为 59.3 盖 C 基因候选基因 位的区间中。 关键词： 水稻；剩余杂合体（ 硅含量 C 基因；候选基因 is of in of is a is by in (is a In a a on of by In 3 21 is in on of in of to in on of 3 of 2:3 as A 5 by 21 F2 21 F3 u 005. in TS in LS in TS in OD 5.5 OD .0 18.9 cM 9.8 cM of in LS in OD OD .0 cM 9.3 cM of C 2 HL 006. By of of SR By a 279 .7 cM .4 cM in SR to a in .); C 文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 增片段长 度多态性 切扩增序列多态性 合区间作图法 倍双倍体 达序列标签 n 叶硅含量 间作图法 子标记辅助选择 等基因系 合酶链式反应 量性状座位 机扩增多态性 制性片段长度多态性 余杂合体 组自交系 列特性扩增区域 核苷酸多态性 单序列长度多态性 单序列重复 n 秆硅含量 录 摘 要 . I . 文缩略表 . 一章 文献综述 . 1 用的 子标记 . 1 记 . 2 记 . 3 记 . 3 记 . 3 记 . 4 记 . 4 位的群体 . 4 2群体和 . 5 组自交系群体 . 5 倍单倍体群体 . 5 等基因系群体 . 5 余杂合体群体 . 6 析方法 . 6 标记的定位方法 . 6 间作图法 . 7 合区间作图法 . 7 合线性模型方法 . 7 稻 研究进展 . 7 初级定位 . 8 精细定位 . 8 稻 图位克隆和分子标记辅助选择 . 9 稻硅的研究 . 9 稻对硅的吸收 . 10 在水稻体内的分布 . 10 对水稻的作用 . 11 稻硅的遗传学研究 . 12 稻中 C 基因的研究进展 . 13 研究论文内容的提出 . 13 第二章 水稻硅含量 定位 . 15 料和方法 . 15 子标记分析 . 16 提取 . 16 V 记检测 . 16 含量测定 . 18 据处理 . 19 果与分析 . 20 型变异 . 20 析 . 21 论 . 23 第三章 水稻色素原基因 C 的精细定位 . 25 料与方法 . 25 稻材料和田间实验 . 25 子标记检测 . 26 据处理 . 27 果与分析 . 27 基因的初步定位 . 27 基因的精细定位 . 28 论 . 30 第四章 全文结论与展望 . 32 论 . 32 稻硅含量 定位 . 32 稻色素原基因 C 的精细定位 . 32 望 . 32 参考文献 . 33 致谢 . 43 作者简历 . 44 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 1 第一章 文献综述 水稻（ .）是世界上最重要的粮食作物之一，全世界约有一半的人以大米为主食。此外，禾本科植物基因组的共线性特征和水稻具有较小的基因组（约 389使得水稻成为单子叶植物基因组的模式植物，并于 2005 年发布了全基因组精细图谱（ 2005）。 生物性状一般可分为质量性状和数量性状。质量性状一般受单基因控制，表现为非连续性变异，在分离群体中可明确分组；数量性状受多基因控制，单个基因效应较小， 易受环境的影响，在分离世代中表现为连续变异，不能明确分组。植物许多重要的经济性状或农艺性状，如产量、品质、病虫害抗性及抗逆性等，都属于数量性状（ ， 1960），改良这些数量性状是作物育种的重要目标。因此，研究数量性状的遗传规律具有重要的意义。 传统的数量遗传学采用数理统计学的方法把控制某一个性状的多个基因作为一个整体研究，这种方法难以有效地研究控制性状表达的基因的数目、基因在染色体上的位置，基因的效应和作用方式。解决这一问题的突破口在于能否将影响数量性状的多个基因剖分开来，将其定位在染色体上， 并最终确定与之有关的 列。近几十年来，随着 子标记技术高速发展，并构建了水稻等重要的饱和分子标记图谱，可以将复杂的数量性状剖分为由若干离散的孟德尔因子所决定的组分，并进而确定其在染色体上的位置及其与其它基因的关系（徐云碧， 1990， 1993）。 用的 子标记 遗传标记（ 指染色体、染色体某一节段或者某个基因座在家系中的任何一种遗传特性。它具有两个特征，即可遗传性和可识别性。迄今遗传标记主要包括形态标记（ 细胞 学标记（ 生化标记（ 分子标记（ 其中前三种遗传标记都是以基因表达的结果（表现型）为基础的，是对基因的间接反映，而 子标记则是 平遗传变异的直接反映。 形态标记是植物的外部形态特征，如：矮秆、紫鞘、卷叶等。形态标记具有简单直观、经济方便等优点。但形态标记的数量在多数植物中是有限的，多态性比较差，表型易受环境影响，还有一些标记与不良性状的基因连锁。因此，形态标记在作物遗传育种中的作用是有限 的。 细胞学标记是植物细胞染色体的变异，包括染色体核型（染色体数目、结构、随体有无、着丝粒位置等）和带型（ C 带、 N 带、 G 带等）的变化。细胞学标记需要较多的人力和花费较长的时间，难度很大，因此，到目前为止，真正应用于作物遗传育种研究中的细胞学标记还很少。 生化标记主要包括同工酶标记和等位酶标记。但目前可使用的生化标记数量还相当有限，且有些酶的染色方法和电泳分离技术有一定难度，因此其实际应用受到一定限制。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 2 分子标记亦指 子标记，是以生物大分子的多态性为基础的一种遗传标记。 分子标记与形态标记、细胞标记、生化 标记相比较，有以下几方面的优点：在植物体的多个组织及生育阶段均可检测到，不受时空限制；数量多，遍及整个基因组；有许多标记表现为共显性，能够鉴别基因型纯合与否，提供完整的基因型。 分子标记大多以电泳谱带的形式表现， 根据 致可以将分子标记分为三类： 第一类是以分子杂交为核心的分子标记技术，包括限制性片段长度多态性标记（ 简称 原位杂交（ ；第二类是以聚合酶链式反应（ 简称 核心的分子标记技术，包括随机扩增多态性 称 简单序列重复标记（ 称 简单序列长度多态性（ 称 扩 展片段长度多态性标记（ 称 序标位（ 称 序列特征化扩增区域（ 简称 ；第三类是一些新型的分子标记，如：单核苷酸多态性（ 简称 表达序列标签（ 称 。 下面将介绍其中常用的 记 最早发现并应用于图谱构建和基因定位的 第一张植物 ， 1986）报道后两年，美国康乃尔大学以 ， 1988）。 1994年，同一研究组又发表了应用新群体构建的第二张水稻分子图谱（ ， 1994）。在这张图谱中，已在第一张图谱中定位的探针的线性排列得到证实。新图谱共含 722个标记，其中 620个为 一年，日本的水稻基因组计划（ 发表了他们构建的分子图谱（ ， 1994），含 1383个标记，其中 1148个为 图谱至 1998年标记数已达 2275个（ ， 1998），新增加的标记仍主要为 2000年进一步饱和，其中涵盖了 3267个 ），为水稻基因组测序计划和基因定位研究提供了极大便利。 入、缺失、重排等所造成的限制性片段数目和长度的差异。通过凝胶电泳技术，将其按大小分离开来，然后经 放射自显影，探测到与探针杂交的特定的 不同个体间在与该探针同源的 会表现出限制性片段长度的多态性，这个探针 就是一个分子标记（郑康乐， 1991）。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 3 复性和共显性，同时又为不同研究结果的比较提供了基础，使得这种标记成为植物基因定位研究中最主要的分子标记；但由于 时、费力，且需要放射性同位素，所以逐渐地被其它更安全、更易检测的分子标记所代替。 记 记 由 于 1990 年创立，是第一种广泛应用于生物遗传变异检测和基因定位的 记。 其 基本原理 是 用一个 （ 有时用两个 ） 随机引物 （ 一般 8 10 个碱基 ） 非定点地扩增 段，然后用凝 胶电泳分开扩增片段。 该类标记的 特点包括： （ 1） 不需 针，设计引物也不需要知道序列信息； （ 2） 技术简单， 析不涉及 交、放射自显影或其它技术； （ 3） 不象 析， 析只需少量 品； （ 4） 记一般是显性遗传（极少数是共显性遗传的），这样对扩增产物就可记为 “ 有 /无 ” ，但这也意味着不能鉴别杂合子和纯合子； （ 5） 析中存在的最大问题是 检测结果不够稳定，缺乏可靠的重演性（ 1995）。 记 记通常是由 记转化而来的。其基本原理是根据 记片段从凝胶上回收并进行克隆和测序的碱基序列设计一对特异性引物（ 18基左右），也可只对该 记片段的末端进行测序，根据其末端序列，在原来 用的 10 个碱基引物上增加相邻的 14 个左右碱基，成为与原 段末端互补的特异引物。以此特异引物对基因组 进行 可扩增出与克隆片段同样大小的特异带。 记一般表现为扩增片段的有无，为一种显性标记；但有时也表现为长度的多态性，为共显性标记。若检测 的差异表现为 扩增片段的有无，可直接在 应管中加入溴化乙锭，通过在紫外灯下观察有无荧光来判断扩增片段的有无，从而检测 的差异，这样可省去电泳的步骤，使检测变得方便、快捷、可靠，可以快速检测大量个体。与 记相比， 记由于所用引物较长及引物序列与模板全互补，因此，可在严谨条件下进行扩增，结果稳定性好、可重复性强。 记 995年报道。 法 是选用一种多切点限制性内切酶和一种寡切点限制性酶，同时酶解基因组 链酶切片段的粘性末端接上人工接头，作为 而检测其多态性。 1）由于 目很多，所以从理论上该技术所产生的标记数目是无限多的；（ 2）典型的 次反应产物的谱带在 50以一次分析可以同时检测到多个座位，且多态性极高； （ 3）测效率高；（ 4）分辩率高，结果可靠；（ 5） 因标记的中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 4 获得程序复杂 ，成本较高；（ 6） 一般实验室开展此 项技术尚存在一定困难。 记 一类由 1于同一座位上串联重复子拷贝数不同，构成了不同的等位基因。利用重复子两侧单拷贝序列设计 为简单序列长度多态性，扩增后可得到丰富的等位基因多态性（ ， 1993； ， 1997）。 有稳定、简便、多态性丰富、 果分析容易等优点，因此成为遗传学研究的重要标记。近年来， 2001年还只有500个标记（ ， 2001）， 2002年增加到了 2740个（ 2002），在水稻完成测序后，对全基因组序列的分析发现，在水稻全基因组中潜在可利用的 8， 000余个（ 2005）。 记 标记 是特异引物 际上是一些特异引物 一种延伸。其基本原理是当 种补救的办法就是用限制性内切酶对扩增产物进行酶切，然后通过琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳将酶解产物分开。 需 复性高、操作简便、成本低等优点而受到广泛的应用。 位的群体 构建分子标记连锁图，必须要有一个分离群体。分离群体和与之对应的连锁图是进行 要条件。根据分离群体在 其分为初级群体和次级群体（吴为人 等 ， 2000）。根据初级群体的特征，又可分为暂时性群体和永久性群体。 初级群体是指由两个遗传差异很大的原始亲本相互杂交而建立的分离群体，其特点是全基因组均发生分离，这类群体主要包括 组自交系（ 体、加倍单倍体（ 体； 次级群体是指在初级群体的基础上，通过近等基因系或导入系或染色体片段代换系（相互或与原始亲本）杂交而建立 的分离群体。其特点是仅在亲本间有差异的染色体区段发生分离，从而有效地减少遗传变异的干扰 。用来发展次级群体的稳定的亲本材料，称为次级群体系，主要包括近等基因系（ 体、渗入系（ 体、染色体替换系（ 体等。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 5 2群体和 过杂交产生 后经过自交获得的群体。具有构建快，且能提供最为丰富的遗传信 息。应用 以直接将加性效应和显性效应分开（ ， 1987），但由于 交后代发生分离，是一种暂时性群体，难于进行重复实验。表型鉴定也是以单株为基础，对于遗传力低的农艺性状， 此，应用有效应较大和表达较稳定的 1988）。虽然可以应用 由于降低了显性效应，将导致遗传效应估算值偏低（庄杰云等， 2001）。 过杂交产生 后和亲本杂交获得的群体 。它也是一种暂时性群体，由于缺少一种亲本型，难于直接分解加性效应和显性效应，应用局限性较大，现已较少用于 （ 1996）提出了用高代回交群体进行 （ 该法可将 而得到较广泛的应用（ ， 1998； ， 2000）。 组自交系 群体 重组自交系群体是通过杂交产生 后经过单粒传、连续多 代自交而产生的。该群体的每个株系的遗传组成比较稳定，属于永久性群体。它可通过设置重复实验测量数量性状，减少实验误差；还可以多代保存，种植于不同环境、不同年份，研究基因型与环境的互作效应。由于多代自交，使染色体间的重组机会大大增加， 此，应用 1996）。 且易产生严重的偏分离。 日本水稻基因组计划将籼梗交 行水稻的 ， 2001）。 倍单倍体 群体 加倍单倍体群体是单倍体经过染色体加倍形成的，一般通过花药培养，即取 导产生单倍体植株，然后对染色体进行加倍产生 优点是建立 以反复使用，重复实验。但是植物的花培能力跟基因型关系密切，因而花培过程会对不同基因型的花粉产生选择效应，从而破坏 成较严重的偏分离现象，从而影响遗传作图的准确性，因此，如果是以构建分子标记连锁图为主要 目的， 等基因系群体 近等基因系群体是指通过反复回交获得的带有供体目标导入染色体片段而其它基因组成与轮回亲本一致的株系。应用近等基因系构建的群体可以在相同的遗传背景下，将多个 数量性状化为质量性状，从而进行精细的基因定位和图位克隆（ 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 6 1997）。 次分子标记筛选。 余杂合体 群体 剩余杂合体（ 体是 通过杂交产生 后经过单粒传、连续多代自交而产生的。 是近年 来提出的一种新型的精细定位群体。与 遗传背景中存在两种双亲基因型，而不是仅含轮回亲本的一种基因型，并且只要利用一次分子标记选择。目前， ， 1997， 1998）、拟南芥（ ， 2005）、大豆 （ ，2005）和水稻（ ， 2006）等植物 析方法 作物中大多数重要的农艺性状和经济性状，如产量、品质、生育期、抗逆性等都是数量性状。这类性状由多基因控制，其遗传基础比较复杂，对大多数的研究不能采用与质量性状相同的方法进行 （ 1941）。传统的遗传学是利用生物统计学来对导致数量性状变异的所有基因的总和效应进行分析，不能用孟德尔的方法来研究单个基因的作用。分子标记技术的出现，为深入研究数量性状的遗传基础提供了可能。控制性状的基因在基因组中的位置称为数量性状基因座（ 利用分子标记进行遗传连锁分析，可以检测出 位。 利用 记进行 位的遗传学原理是：当分子标记与某一个性状的 锁时，不同标记基因型的个体的表型值将存在显