华南师范大学实验报告.doc

华 南 师 范 大 学 实 验 报 告学生姓名 林 鸿 锦 学 号 专 业 综合理科二班 年级、班级 07级 课程名称 生物化学实验 实验项目 脂肪酸的氧化 实验类型 验证 设计 综合 试验时间 2008 年 11 月 17 日实验指导老师 陈 文 利 实验评分 一、目的通过测定和计算反应液内丁酸氧化生成丙酮的量，掌握测定-氧化作用的方法及其原理。二、原理在肝脏内脂肪酸经-氧化生成乙酰辅酶A，两分子乙酰辅酶A缩合成乙酰乙酸。乙酰乙酸可脱羧生成丙酮，也可还原生成-羟丁酸。乙酰乙酸、-羟丁酸和丙酮总称为酮体。本实验用新鲜肝糜与丁酸保温，生成的丙酮可用碘仿反应测定。在碱性条件下，丙酮与碘生成碘仿。反应式如下：剩余的碘可用标准Na2S2O3滴定：根据滴定样品与滴定对照所消耗的硫代硫酸钠溶液体积之差，可以计算由丁酸氧化生成丙酮的量。三、材料、试剂和仪器（一） 材料 新鲜兔肝（二） 试剂1、0.1%淀粉溶液（溶于饱和NaCl）2、0.5mol/L丁酸溶液3、20%三氯乙酸溶液4、10%氢氧化钠溶液5、10%盐酸6、0.1mol/L碘溶液7、标准0.02mol/L硫代硫酸钠溶液8、1/15mol/L，pH7.6磷酸盐缓冲液（三） 器具1、 漏斗2、 碘量瓶3、 试管及试管架4、 移液管（5mL，10mL）5、 碱性滴定管6、 恒温水浴锅四、实验过程（一） 肝匀浆的制备 实验室已准备好新鲜的兔肝匀浆以及煮沸过的兔肝匀浆。（二） 酮体的生成取大试管两支，分别编号，按下表操作。（单位：mL）大试管编号AB加入新鲜肝匀浆-2.0加入预先煮沸肝匀浆2.0-加入pH7.6磷酸缓冲液3.03.0加入正丁酸溶液2.02.037恒温水浴保温40min后分别加入20%三氯乙酸，摇匀后室温放置10min。现象及分析溶液呈乳白色，沉淀不明显（煮沸的时候蛋白质已变性）有大量暗褐色沉淀（与三氯乙酸反应，蛋白质变性）分别过滤，收集滤液，得无蛋白溶液。 加入三氯乙酸前的B试管 加入三氯乙酸后（左A右B，A中部分溶液已在过滤） （三） 酮体的测定取碘量瓶两只，编号后按下表操作。（单位：mL）碘量瓶编号AB加入无蛋白溶液5.05.0加入0.1mol/L碘液3.03.0加入10%氢氧化钠溶液3.03.0放置10min，各瓶溶液均呈浅黄色（碘仿颜色）。再分别滴加10%盐酸3mL，使各瓶溶液中和。现象及分析红棕色较深（碘较多）红棕色较浅（碘较少）用0.02mol/L硫代硫酸钠溶液滴定至碘量瓶中的溶液呈浅黄色，往瓶中滴加0.1%淀粉溶液2-3滴，使瓶中溶液呈蓝色。起始刻度2.37.9终止刻度15.119.8消耗量12.811.9 加HCl前 加HCl后的A瓶 加HCl后的B瓶滴定操作（四） 计算试验中所用肝糜中生成的丙酮量（mmol/L）=（A-B）C1/6肝脏生成的丙酮量（mmol/g）=（A-B）C1/621、式中：A为滴定A样品消耗的0.02mol/L硫代硫酸钠溶液的mL数； B为滴定B样品消耗的0.02mol/L硫代硫酸钠溶液的mL数； C为硫代硫酸钠的浓度（mol/L）。2、为什么乘以1/6？ 由实验原理中提供的化学方程式可得到以下关系式：1 CH3COCH3 3 NaOI 3 I2 6 Na2S2O3 即生成丙酮量是消耗的硫代硫酸钠的1/6。3、第二条式子为什么多乘了一个2？ 过程是这样的：5g肝脏，加NaCl稀释至10mL取用2mL，即1g肝脏加各种试剂后体积为10mL取用5mL，即0.5g肝脏。 第二条式子要求的是每g肝脏生成丙酮量，而第一条式子求出的为0.5g肝脏生成的丙酮量，因此要乘以2。4、代入数据计算，试验中所用肝糜中生成的丙酮量（mmol/L）=（12.8-11.9）0.021/6=0.003；肝脏生成的丙酮量（mmol/g）=0.0032=0.006五、实验讨论（一） 注意事项1、 在低温下制备新鲜的肝糜，以保证酶的活性。2、 加HCl溶液后即有I2析出，I2会升华，所以滴定迅速，滴定的速度是前快后慢，当溶液变浅黄色后，加入指示剂就要慢慢一滴一滴地滴。3、 滴定时淀粉指示剂不能太早加入，只有当被滴定液变浅黄色时加入最好，否则将影响终点的观察和滴定结果。因为如果过早加入淀粉指示剂会使淀粉与碘产生络合物，而显蓝色。影响碘仿反应的颜色观察。从而影响滴定结果。（二） 为什么说制备新鲜的肝匀浆是本实验的关键？ 因为催化酮体生成的酶主要在肝细胞线粒体内膜上，肝脏是酮体生成的主要场所。（三） 脂肪酸的-氧化过程脂肪酸的活化 胞浆中的硫激酶催化中短链脂肪酸活化；内质网膜上的酶活化长链脂肪酸，生成脂酰CoA，进入内质网用于甘油三酯合成；线粒体膜上的酶活化的长链脂酰CoA，进入线粒体进入-氧化。脂酰CoA进入线粒体 长链脂肪酰CoA和载体肉毒碱脂酰转移酶I反应，生成辅酶A和脂酰肉毒碱，后者进入线粒体内膜。位于线粒体内膜内侧的肉毒碱脂酰转移酶又使脂肪酰肉毒碱转化成肉毒碱和脂酰CoA，肉毒碱重新发挥其载体功能，脂酰CoA则进入线粒体基质，成为脂肪酸-氧化酶系的底物。脂肪酸的-氧化 脱氢(dehydrogenation)反应，生成具有反式双键的,-烯脂肪酰辅酶A。加水（hydration)反应，生成具有L-构型的-羟脂酰CoA。脱氢反应，生成酮脂酰CoA。硫解（thiolysis)反应，生成乙酰CoA和一个少两个碳原子的脂酰CoA。（四） 脂肪酸-氧化的生理意义 脂肪酸-氧化是体内脂肪酸分解的主要途径，脂肪酸氧化可以供应机体所需要的大量能量。脂肪酸-氧化也是脂肪酸的改造过程，机体所需要的脂肪酸链的长短不同，通过-氧化可将长链脂肪酸改造成长度适宜的脂肪酸，供机体代谢所需。脂肪酸-氧化过程中生成的乙酰CoA是一种十分重要的中间化合物，乙酰CoA除能进入三羧酸循环氧化供能外，还是许多重要化合物合成的原料，如酮体、胆固醇和类固醇化合物。（五） 脂肪酸的特殊氧化形式1、丙酸的氧化奇数碳原子脂肪酸，经过-氧化除生成乙酰CoA外还生成一分子丙酰CoA，某些氨基酸如异亮氨酸、蛋氨酸和苏氨酸的分解代谢过程中有丙酰CoA生成，胆汁酸生成过程中亦产生丙酰CoA。丙酰CoA经过羧化反应和分子内重排，可转变生成琥珀酰CoA，可进一步氧化分解，也可经草酰乙酸异生成糖。2、-氧化脂肪酸在微粒体中由加单氧酶和脱羧酶催化生成-羟脂肪酸或少一个碳原子的脂肪酸的过程称为脂肪酸的-氧化。长链脂肪酸由加单氧酶催化、由抗坏血酸或四氢叶酸作供氢体在O2和Fe2+参与下生成-羟脂肪酸，这是脑苷脂和硫脂的重要成分，-羟脂肪酸继续氧化脱羧就生成奇数碳原子脂肪酸。-氧化障碍者不能氧化植烷酸(phytanic acid,3,7,11,15-四甲基十六烷酸)。3、-氧化 脂肪酸的-氧化是在肝微粒体中进行，由加单氧酶催化的。首先是脂肪酸的碳原子羟化生成-羧脂肪酸，再经醛脂肪酸生成,-二羧酸，然后在-端或-端活化，进入线粒体进入-氧化，最后生成琥珀酰CoA。4、不饱和脂肪酸(unsaturated fatty acid)的氧化 体内约有1/2以上的脂肪酸是不饱和脂肪酸，食物中也含有不饱和脂肪酸。这些不饱和脂肪酸的双键都是顺式的，它们活化后进入-氧化时，生成3-顺烯脂酰CoA，此时需要顺-3反-2异构酶催化使其生成2-反烯脂酰CoA以便进一步反应。2-反烯脂酰CoA加水后生成D-羟脂酰CoA，需要-羟脂酰CoA差向异构酶催化，使其由D-构型转变成L-构型，以便再进行脱氧反应(只有L-羟脂酰CoA才能作为-羟脂酰CoA脱氢酶的底物)。不饱和脂肪酸完全氧化生成CO2和H2O时提供的ATP少于相同碳原子数的饱和脂肪酸。（六） 课外拓展：奶粉添加脂肪酸可增加婴儿智慧一项新研究显示，在婴儿喝的婴儿奶粉中添加两种脂肪酸可能增加婴儿智慧。研究员研究56名喂食婴儿奶粉的孩子，一些孩子的婴儿奶粉内添加两种特殊脂肪酸，另一些孩子没有添加这些脂肪酸，结果喝了有脂肪酸婴儿奶粉的婴儿在记忆力、解决问题能力和学习语言能力等各方面都比没有喝脂肪酸的婴儿高七个百分点。这两种脂肪酸是二十二碳六烯酸和花生四烯酸。事实上人类母奶内都含有这两种脂肪酸，过去对