【毕业学位论文】(Word原稿)香蕉内生菌群落结构多态性及其枯萎病生防菌筛选-植物病理学

12345 分类号： 单位代码： 10389 密 级： (没有不用写 )学 号： (S/B) 福建农林大学硕士论文 香蕉内生菌 群落结构 多态性 及其枯萎病 生防 菌 筛选 学 科 门 类： 一级学科名称： 二级学科名称： 研 究 方 向：植物病理学 研 究 生： 指 导 教 师： 博士、 研究员 博士、 研究员 完 成 时 间：二 年四月 2 目 录 中文摘要 . 1 英文摘要 . 2 第一章综述 . 3 1 枯萎病的生物防治研究进展 . 3 2 生防细菌的来源 . 4 植物内生细菌 . 4 病机制 . 5 争作用 . 5 抗作用 . 7 3 植物内生菌研究进展及其存在的问题 . 9 4 生防细菌的定殖研究 . 10 . 10 5 宿主一内生菌一内生菌之间的关系 . 12 主与内生茵关系 . 12 生菌之间相互关系 . 13 第二章香蕉内生菌群落结构多态性研究 . 14 . 14 验材料 . 14 生细菌的分离 . 14 . 15 2. 结果与分析 . 16 . 16 3 小结与讨论 . 20 第三 章香蕉枯萎病内生拮抗细菌的筛选及鉴定 . 21 1 材料与方法 . 21 . 21 . 21 2 结果与分析 . 23 3 . 23 . 25 绿假单孢菌的测定 . 26 第四章 不同培养条件对香蕉内生生防菌生长的影响 . 31 1 材料与方法 . 31 . 31 . 31 . 31 . 31 . 32 . 32 . 32 . 33 46号铜绿假单胞菌株生长的 影响 . 34 . 34 . 35 第五章培养条件对 铜绿假单胞菌定殖香蕉组培苗的影响 . 37 1 材料与方法 . 37 试菌株 . 37 . 37 . 38 . 38 单胞菌定殖的影响 . 38 2 结果与分析 . 39 . 39 孢镰刀菌回接香蕉盆栽苗致病性检 测 . 40 . 40 液直接加入） . 41 根法） . 41 第六章 总结与展望 . 42 4 参考文献 . 43 致谢 . 47 1 中文摘要 枯萎病是一种毁灭性的土传病害，该病的生物防治 已经受到世界各国的极大关注，为获得优良性状的生防菌直接为生产服务，本论文从菌种鉴定筛选鉴定，抑菌机理，发酵条件，定植状况，等方面对香蕉枯萎病的生防细菌进行了较系统的 研究 。 以香蕉枯萎病病原菌尖孢镰刀菌为靶标菌， 对福建省漳浦县的两株香蕉植株和一株 米蕉植株进行进行了分离和 拮抗细菌的筛选。 同时对部分菌株 进行了鉴定 。 另外，对本试验 室 的四株对枯萎病有拮抗 作用的铜绿假单孢 菌 进行了筛选，选取 一种进行了 生理生化实验，并对这株菌进行了微生物试验，以及对其侵入组培苗的条件进行了初步探索。 关键词， 香蕉枯萎病 内生细菌，内生生防菌 2 英文摘要 is a of It to of by To in of f. by nd of 4 is nd in 3 第一章综述 1 枯萎病的生物防治研究进展 植物枯萎病是由镰刀菌寄生引起的一种世界性的真菌土传病害，其主要的致病菌是尖孢镰刀菌（ ，病原菌从根部为害植物，引起维管束病害，造成植株枯死，在植株的全生育期均可发生。该病害在 3内就会由零星点片发展为普遍流行性病害，以瓜类枯萎病为例，病田一般减产 20 严重田块可达 50甚至绝产。目前，在世界范围已报道的被严重为害的经济作物有棉花、甘蔗、香蕉、番茄、黄瓜、节瓜、冬瓜、西瓜、南瓜、西葫芦、甜瓜、丝瓜 、白瓜（越瓜）、苦瓜、葫芦瓜、哈密瓜、四季豆、豇豆等。目前，对于该病的防治主要有抗病育种法、轮作换茬法以及最广泛采用的药剂防治法等。但抗病品种的抗病能力维持时间较短且目前品种的抗性与丰产、优质还未达成有机的统一；由于土地资源有限，轮作方法也不易实施；一直以来，化学防治是控制土传病害的主要手段，但随着化学农药的大量使用，产生了环境污染、农药抗性及农药残留等令人担忧的问题，而且迄今为止还没有一种化学农药可以有效地控制枯萎病的发生。因此，利用微生物及其代谢产物等生物农药进行防治，使用对人体和生态环境无害的生防菌剂 替代化学农药已成为世界范围内的发展方向。 香蕉是我国南方的五大名果之一，是国内消费和出口创汇的一个重要资源。但是，随着香蕉生产的发展，香蕉病害的危害也日益严重，尤其是香蕉枯萎病给我国香蕉生产带来极大的威胁，加强香蕉枯萎病的防治迫在眉睫。香蕉枯萎病是一种毁灭性病害，一种靠土壤和苗木传播的真菌性病害，通过灌溉水流动和染病吸芽繁殖材料传播。虽然该病已经受到国内外的关注，但是到目前为止，对该病的防治方面仍不容乐观。目前推广的抗病品种 （舒肇苏 (台蕉 1 号、 2 号、 等 )，农艺性状不佳 (产量 低、植株太高 )，品质较差。 4 采用土壤清洁 措施均无效果，生长期使用杀菌剂药液灌溉法，防治效果也不理想 （林兰稳， 2003） ，而且长期使用化学农药容易引起抗药性，影响 生态环境，对香蕉的品质，生产，出口等方面也不利。因此无公害控制病害已成为植保工作者的目标，而香蕉枯萎病生物防治 已经成为各国研究的热点 ，国外研究者分离获得 链霉菌 （ 荧光假单胞 （ ， 003） ，枯草芽孢杆菌（ 绿农杆菌（ S Y， ， ， 香蕉枯萎病具有明显的抑制作用； 2003？） 等研究报道，抗病品种的种植与生防菌的施用相结合，对香蕉枯萎病的防效达 95%以上（ ， ， ； 说明生物防治香蕉枯萎病是完全可行的。我国从事香蕉枯萎病生物防治的研究刚刚起步， 2003 年，曹理想等从香蕉组织内分离到几株内生菌对该病有不用程度的抑制作用，但抑制效果不理想 （曹理想 ， 2003） 。 本 课题组从果园土壤中分离到几株对香蕉枯萎病菌有及其显著抑制作用的拮抗菌，并对这些拮抗抑制香蕉枯萎病菌的作用进行了测定，为开发香蕉枯萎病的生防制剂打下基础。 2 生防细菌的来源 高等植物在充满微生物的环境中生长发育，由于其共同进化产生不同类型的微生物 据生境不同，微生物可分为附生和内生两类。附生菌 （ 指在寄主体表生长的微生物，根 据 附 生 部 位 又 可 分 为 根 际 （ 微 生 物 和 体 围（ 生物两类 （王金生， 1999）。 植物内生菌是指存在于植物体内 对植物没有危害的一类微生物，能够定殖在植物细胞间隙或细胞内，并与寄主植物建立和谐联合关系。 植物内生细菌 植物内生细菌与寄主之间相互依存、互相制约的关系，是内生细 5 菌应用研究的基础。一般认为，植物内生细菌作为植物微生态系统中天然组成成分，它们可能促进了寄主植物对环境的适应，加强了系统的生态平衡。 1993）将 进行玉米螟虫生物防治。由于此实验的成功，许多研究者都认为植物内生细 菌是一个很好的外源基因载体。 目前对植物内生细菌的研究主要涉及两方面的内容。一是内生细菌是否是植物病害潜在的感染源。二是对内生细菌的生态学、生物多样性以及群落分析的生态学研究：把栖息于宿主组织内的全部细菌群落包括病理学范围的潜伏的或条件致病的一些病原细菌认为是植物微生态系统的正常群落。整个植株是一个复杂的微生态系统。高等植物分为根、茎、叶、花及果实、种子。这些不同的部位都是植物正常微生物群的不同生境，其间存在着一系列不同的微生物群落。在健康植物微生态系统中，这些微生物群落通过相互作用建立了一种微生态平衡。 病机制 人们普遍认为拮抗细菌的防病促生机制是几种或多种机制协同起作用 （ et 1993）。 了解生防细菌的生防机制，以便有针对性地加以利用，有目的地改进剂型及使用方法，使其生防潜力得到最大限度的发挥，对于成功、高效地利用生防细菌防治作物病害具有十分重要的意义。 细菌拮抗土壤有害微生物的机理涉及 竞争（ 1992； 2000） 、拮抗（ 2002） 、寄生（ 林茂松， 1993） （图 1） ？ 、促进植株生长（ 徐进， 2004） 、诱导植物抗性（陈志谊， 2001）、致弱 （ 刘波， 2004）等方面。 争作用 生防菌和病原菌之间的竞争包括营养物质的争夺、物理位点和生物学位点的抢占等。生防细菌对生态环境具有极强的适应能力，再加 6 上其代谢迅速、繁殖快，在空间的占领及其它方面的竞争中处于有利地位，生防菌优先占领一定的生存空间后，形成一层天然的物理屏障来抵御病原菌的侵染。生防菌可以通过营养如 C， 争，使病原菌丧失充足的营养从而生长受到限制。另外， 生防细菌产生嗜铁素（ 争 制病原菌的生长也是一个重要的生防机制（ et 1986； 1985； et 1984）。生态位的排斥是生防细菌拮抗病原菌的另一重要机制（ 1982）。根上的特殊位点如细胞间隙和根伸长处，存有大量根分泌物，有利于 细菌定殖。 图 1 拮抗菌与病原真菌的相互作用（ et 2003） 种混有生防细菌的肥料可以阻碍病原菌在这些位点的定殖。拮抗微生物与病原菌对植物寄主分泌的营养 的竞争是一个普遍的现象。如在棉花种子的分泌物中，含有亚油酸等长链脂肪酸，它们是 孢子萌发所必须的。而阴沟肠杆菌 转座子插入到 . 生防作用也就随之丧失了。但把野生型 变体的生防能力又得到恢复。这些结果证明， E. 肪酸的竞争性利用而抑制病原菌（ et 1997a； 1997b）。微生物在根部的实际密度与根表面积之比非常低，因此有人认为生防菌空间位点的竞争 7 不是其主要的生防机制，比如 1988）认为细菌在根围定殖的过程中主要是竞争营养而不是竞争空间。 抗作用 拮抗作用是指生防菌能够产生对病原菌具有拮抗作用的物质，这些物质包括： 毒素； 溶菌酶或蛋白酶等，如果胶酶、葡聚糖苷酶、蛋白酶、几丁质酶、磷脂酶等； 缺陷型噬菌体； 具有抗菌作用的代谢产物，如氨类、有机酸等初始代谢的副产品和 其它次生代谢物； 抗生素； 细菌素或细菌素类似物等（ 1990）。如几丁质酶、抗生素、细菌素等，这些物质通过干扰敏感病原菌的代谢过程而限制、控制或影响病原菌的生存活动，甚至杀死病原菌。如放射土壤杆菌所产生的细菌素 扰其吸收作用（ 1980）；软腐欧式杆菌的细菌素能引起敏感细胞中磷脂的降解（王金生， 1985）。通常在培养皿中看到的抑菌圈就是抗菌物质作用的表现。一般所产生的抗菌物质都是有机物质，它们在低浓度下就能对其他微生物的生长和代谢产生抑制效应，由 于从死亡的细胞还可以释放出抗菌物质，所以即使是产生抗菌物质的微生物已经停止生长，但抗菌物质所产生抗菌作用还在继续发挥，抗菌作用是比较稳定的。 几丁质是多数真菌细胞壁以及无脊椎动物体壁的主要结构成分，许多细菌、真菌及受诱导后的植物，在合适的条件下，能产生一些水解酶，将病原菌细胞壁水解。目前，研究较多的水解酶为几丁质酶和3葡聚糖酶，人们己对这两种酶的性质及抑菌活性做了广泛研究，这两种酶的酶解活性和抑菌范围各不相同，两种酶混合作用时，可增加抑菌范围 （ et 1993； 1991； et 991； et 1988；但汉鸿， 1998）。 细菌素是由细菌的某些菌系所产生的对该种细菌以外的一些菌株或关系较近的细菌有杀伤作用、非复制性的含蛋白的抗菌物质。细菌素分为两大类，一类是分子量较小，对胰蛋白酶敏感，耐热；另一类是分子量较大，在电镜下有一定的形状，类似噬菌体或噬菌体的碎 8 片，对胰蛋白酶不敏感，也不耐热。抗生素是微生物所产生的具有生物活性的物质，它在低浓度下就能抑制或影响其它生物的机能，从而对敏感微生物产生抑制或致死作用。传统 的生物防治主要是研究有益微生物的活体应用，从现代植病观点来看，应用微生物有益代谢产物来进行病害防治的方法也应列入生物防治的范畴（黄大昉， 2001）。 生防细菌还可产生多肽类活性物质。如在芽孢杆菌产生的抗菌肽中，多数抗细菌，少数抗真菌。 1984）等从蜡状芽孢杆菌（ B 纯化出一种抗真菌环状多肽 抑菌谱广，活力强，能同时对丝状真菌和酵母起作用，且耐热性和稳定性好。裴炎等（ 1999）报道从蜡状芽孢杆菌 中分离出抗真菌多肽 度为 2g/可抑制黑曲霉和瓜果腐霉。刘颖等（ 1999）从枯草芽孢杆菌中分离出抗真菌肽 一种广谱抗真菌小肽，对瓜果腐霉病菌（ 玉蜀黍赤霉病菌（ 长柄链格孢（ 水稻稻梨孢（ 有很强的抑制作用。孔建等（ 1999）报道枯草芽孢杆菌 生一种耐高温抗菌物质，有广泛的抑菌谱，包括土传镰刀菌（ 气传植物病原菌如苹果轮纹病 （ 番茄早疫病（ 韧皮部病菌。近年来多肽类抗生素的研究日益受到重视，研究的进一步发展可通过基因定点突变技术对其分子结构进行修饰，以提高其活性。如 （ 1988）采用该技术修饰抗菌肽 其活性提高了 100 倍，既方便，成本又低。 至今发现 的拮抗细菌能产生 100 多种抗菌物质，其中绝大多数为肽类抗生素，分子量 300们可能含有 般能抵抗蛋白酶的降解。这些 抗菌物质包括： 环状肽或环状脂肽，分子量 1000右： , 线状肽： 氨基糖苷类抗 生 物 ： 5究证明 的拮抗细菌的防病作用与其产生的 9 抗生 素有很大的关系。 （ 1994）从土壤中分离到 株，该菌株可以抑制由卵菌引起的病害，如 起的苜蓿猝倒病。研究发现该菌可以产生两种抗生素： 和 是一种氨基多元醇，化的 抑制 芽管的伸长而 起孢囊的膨胀。用转座子丝裂霉素 C 诱变 获得 5 个抗生素减少的突变体，这 5 个突变体的生防能力都显著下降，而向突变体处理的苜蓿的根部再加入 或 蓿猝倒病又被明显抑制，说明两种抗生素在 制苜蓿猝倒病中起重要作用（ 1991； 1995）。 3 植物内生菌研究进展及其存在的问题 植物内生菌是一个多样性十分丰富的微生物类群，分布于没有外在感染症状的健康植物组织内，并与宿主植物协同进化，其存在和作用长期以来一直为人们所忽视 。随着研究领域的不断拓宽和研究方法的不断深入，植物内生菌的生态和生理作用及其作为潜在的生防资源和外源基因载体，在农业和医药领域中的巨大应用潜力，已逐渐成为国内外研究的热点 。 植物内生菌的研究其始于 19世纪中叶， de 先提出植物内生菌一词 后在几种牧草植物中发现了内生真菌，对植物内生菌并没有进行更深入的研究，直到 1977年 引起广泛的关注，在其后的十几年时间，侧重与草本植物内生菌研究，特别是对感染内生菌的牧草对草食动物的影响 以及对食叶虫的影响方面研究。 20世纪90年代以后，在植物内生菌方面的研究范围扩大了，不仅仅局限于牧草植物内生菌的研究，也从其他不同植物中分离内生菌，研究其植物生物多样性，生物学作用，侵染途径以及与宿主之间的关系等，特别是 1993年 植物内生菌又有了更深的了解，掀起了从植物内 10 生菌中寻找心物质的热潮，一些心的抗肿瘤，抗菌，抗虫物质先后从内生菌中分离出来，在研究植物内生菌的过程中引入了现代分子生物技术，从而使对内生菌的研究进入了分子水平，植 物内生菌的来源于外界环境微生物，以不同方式进入植物组织中，通过水平和垂直方式进行传播，其遗传与代谢都由于与宿主在长期共同进化过程中相互作用而有别与外界环境微生物。几乎所有的植物中都有生活的内生菌，现在仅仅对极少数植物内生菌进行了完全的研究，因此从植物内生菌寻找到新物质的饿几率是很大的，并且植物内生菌本身作为新的微生物资源也具有广泛的研究价值。 4 生防细菌的定殖研究 大多数研究者认为（ et 1951），植物内生细菌进入植物体内的方式和途径与植物病原细菌相似，也主要是通 过自然孔口和伤口等进入植物体内。这些孔口主要包括气孔、皮孔、水孔、蜜腺、胚根和次生根形成时的组织伤口、破裂毛状体、根在土壤中伸展时造成的持续不断的擦伤口，以及风吹土粒、雨水造成的叶片损伤、或根部分生组织等。一般认为，细菌没有特殊的穿透结构，它们不能主动穿透完整的表皮细胞。但有研究发现，植物内生细菌除能通过上述自然孔口和伤口进入植物体外，有的还能通过根毛细胞的入鞘作用、根毛与邻近表皮细胞壁水解酶进入植物组织体内。另外内生细菌还可以通过维管束系统进入种子，或通过禾谷类花粉管通道、成熟种子的种脐、种皮的裂缝开口、 种荚、种皮背部索状细胞进入种子，或通过次生根进入分生组织，或通过叶表吐水孔进入叶内等。 1996）报道，用处于根际的致金色假单胞杆菌（ 以从 16种单子叶和双子叶植物的地上部组织中分离到该菌，在植株地上部细菌可通过茎表和叶表侵入植物。研究还发现，根部接种后，茎部经消毒处理，仍可以从地上部植物组织中分离到该细菌。这表明，细菌可以通过植物维管束组织从根部传导 11 至茎部。 内生细菌可以随植株的生长而繁殖运转。在植株生长的各个不 同阶段，其中的细菌群体的数量有较大变化。除了由种子传播的内生细菌外，在内生细菌进入植物内部之前必须首先在根部表面定殖。这些细菌由于趋化性（ 向电性（ 者偶然的碰撞而与宿主相接触。研究 者胞外蛋白（ 泌不足或者是过量表达的 现这一过程可以分为三个阶段：细菌吸附到根部表面（快速但是是一种细菌与宿主之间弱的相互作用）；锚定在根部表面（强的相互作用）；定殖在 根表面的同时，一些细菌进入根内（ et 1989）。 与根围细菌相同，内生细菌在植物组织中的定殖也受多种生物和非生物因子影响。植物相关内生细菌与其它植物内部定殖微生物如其它细菌、真菌、病毒等共同存在。由于它们的生存需要的空间和营养都由寄主植物提供。因此，它们之间必然存在着竞争、拮抗、共生和（或）互利共生等关系。在玉米根部接种丝核菌（ 促进一种肠杆菌（ 一种假单胞菌（ 89定殖（ et 1997）。另外，内生细菌在植物根和茎的较低部位占优势，而内生真菌在茎的中段占优势。内生真菌和细菌的这种关系或许可在实践中用来作为控制根和维管束病原菌的生防因子组合。内生细菌之间也有类似关系。一种系统定殖菌（ 一种根际定殖菌（ 同应用与 一应用相比， 种群密度没有受到影响。然而，当 另一种内生细菌（ 同应用，与各自单一应用相比，这种共存导致了两者的种群密度下降 （ 关于内生细菌与病毒之间的互作了解较少。不过有报道表明马铃薯 X 病毒没有对茎和块茎中的内生细菌种群表现出影响（ et 1974） 。 目前用于检测内生细菌在植物体内定殖的方法，主要有抗生素标记，胶体金荧光免疫电镜观测法、血清学方法、荧光标记等，其中以抗生 12 素标记法较多。在抗生素标记法中又以抗利福平标记为主，大部分内生定殖动态研究均以抗利福平为标记。一旦进入植物组织，有的内生细菌在专一 性植物组织如根皮层成为局部定殖者。有的通过输导组织转运或主动迁移而成为系统定殖者。 到达未开的花和棉铃中。不同的植物细胞组织定殖的内生细菌类群存在差别。一般说来，内生细菌主要定殖于植物细胞间隙，也有一些研究表明内生细菌也可定殖于细胞内。在维管束系统也广泛存在内生细菌，但是，至于维管束系统只是提供一个转运通道还是确实是一个繁殖场所还不太清楚。如果后者具有可能，那么大量的细菌将导致堵塞而致病。这或许可以解释为什么在维管束系统中内生细菌的数量较低。一般情况下，内生细菌的 种群数量级最高为 106g 新鲜组织，而病原细菌的最低数量级为 107g 新鲜组织。据推测，空间限制或许是内生细菌的一个特性。同时或许也是内生细菌与植物病原细菌之间不同的一个主要因素 5 宿主一内生菌一内生菌之间的关系 主与内生茵关系 在宿主与内生菌的长期进化过程中，形成一种共生或互生的关系，不同的植物其内生菌的种类、基因型是不相同的，内生菌对宿主也具有选择，其相互作用还受到环境因子的影响，环境条件和宿主基因型决定内生菌的遗传多样性，环境与宿主基因型的相互作用可能使宿主对某一种特殊内生菌基因 型敏感性会随环境的改变而改变，一种特殊的内生菌基因型需要找到正确的宿主基因型才能成功感染(Ahet 2002)，在宿主的影响下，内生菌的不同亚群会在不同的环境中形成，当宿主植物在环境恶化的情况下，它会选择那些增强其抵抗恶劣环境的内生菌亚群的侵染 (， 2001) 。在宿主与内生菌的相互作用过程中，内生菌的生长代谢行为会受到宿主基因型的影响，有的物质代谢会受到制约，但宿主植物对内生菌的选择性调控更为有利内生菌代谢 (S， Pt 2002) ， 13 001) 等也在研究黑麦草内生真菌在宿主的生长情况发现，任一段 中的内生菌菌丝的平均数量在整个叶片的生长期是保持不变的，随叶片的生长而生长，叶片生长停止菌丝也停止生长。内生菌的代谢行为也影响宿主的生长，内生菌的固氮作用、产生的生长调节物质可以促进宿主植物的生长，对无机磷的溶解可增加宿主营养，诱导宿主植物病虫害防御体系。 生菌之间相互关系 在宿主植物中，内生菌是相互作用，共同起作用促进植物的生长( et 2002 ，但内生菌之间是相互制约的，一种内生菌可能抑制 其中一些其它内生菌而促进另外一些内生菌的生长，使内生菌之间在宿主植物中达到一种动态平衡 (L， et 2001) 14 第二章 香蕉 内生菌群落结构多态性研究 验材料 本采集： 从漳州采集两个品种， 一株带病植株得香蕉，一株健康的香蕉，都处于成果期。一株 健康的米蕉。 养基 普通细菌分离用 养基， 养基 。 养基：牛肉浸膏 3g，酵母浸膏 1g，蛋白胨 5g，葡萄糖 10g，琼脂 18g，蒸馏水 1000mL，养基：马铃薯 200g 蔗糖（或者葡萄糖） 20g 琼脂 17g。蒸馏水 自然 。 酸碱度调节到要求，分装，灭菌（ 121 ） 20养基购自美国 司 生细菌的分离 将采回的健康香蕉植株叶子分 3 个部位，计为叶上部，叶中部，叶基部，每个叶子处理分为叶 基部 ，叶 中部 ，叶 尖部 。茎部分 5 个处理，计为，茎部 1，茎部 2，茎部 3，茎部 4 茎部 5（根茎交接处） ，根部分 2 个处理 ，计为根尖，和根基 ，计为根尖部和根基部，称重。消毒：将各部位样品分别在 75%酒精中浸泡 2s，然后用 汞 溶液消毒 2菌水冲洗 3 次。用灭菌的滤纸吸干水分，加 1菌水于研钵中研磨成匀浆。记为梯度 1。移取研磨液采用系列浓度梯度稀释法进行稀释， 取每个稀释度的菌液 匀地涂布于 板上，其中 养基的平板于 30 人工气候箱中培养。每个处理涂三个梯度，每个梯度作三个重复。 15 自动微生物鉴定系统鉴定（刘志辉等， 2005；张国赏等，2000） 。 肪酸的提取 （ 1）细菌培养条件： 板培养基，四线划线线法，培养温度（ 281） ，培养 时间（ 242） h；（ 2）获菌：用接种环挑取 35 环（约 40重的菌落进入一个干净、干燥的 1300螺旋盖的试管中（最佳的获菌区域为第三区）；（ 3）皂化：加入（ .1）试剂 1，拧紧盖子，振荡 5 10 s，放入 95 100 的沸水中 5温冷却，振荡 5 10 s，再