【毕业学位论文】(Word原稿)苏云金芽孢杆菌发酵液的絮凝浓缩及其杀虫蛋白微胶囊化的研究-生物农药

类号： 单位代码： 10389 密 级： 学 号： (S/B)1061508 福建农林大学硕士学位论文 苏云金芽孢杆菌发酵液的絮凝浓缩及其杀虫蛋白微胶囊化的研究 学 科 门 类：农学 一级学科名称：植物保护 二级学科名称：农药学 研 究 方 向：生物农药 研 究 生： 指 导 教 师： 教授 研究员 完 成 时 间：二 年四月 2006 级农药学硕士学位论文 创性声明 本人声明 ,所呈交的学位（毕业）论文 ,是本人在指导教师的指导下独立完成的研究成果 ,并且是自己撰写的。尽我所知 ,除了文中作了标注和致谢中已作了答谢的地方外 ,论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本研究做出贡献的同志 ,都在论文中作了明确的说明并表示了谢意 ,如被查有侵犯他人知识产权的行为 ,由本人承担应有的责任。 学位（毕业）论文作者亲笔签名： 日期： 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林 大学有关保留、使用学位（毕业）论文的规定 ,即学校有权送交论文的复印件 ,允许论文被查阅和借阅 ; 学校可以公布论文的全部或部分内容 ,可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密 ,在 年后解密可适用本授权书。 不保密 ,本论文属于不保密。 学位（毕业）论文作者亲笔签名： 日期： 指导教师亲笔签名： 日期： 2006 级农药学硕士学位论文 录 第一章 综述 . 1 1 苏云金芽孢杆菌研究进展 . 1 云金芽孢杆菌杀虫机理 . 1 云金芽孢杆菌增效措施的研究进展 . 1 2 微生物农药剂型及微胶囊剂型的研究进展 . 4 生物农药剂型介绍 . 4 胶囊剂型研究进展 . 5 3 思路创新 . 7 第二章 苏云金芽孢杆菌的絮凝浓缩研究 . 8 前言 . 8 1 材料与方法 . 8 验材料 . 8 t 的发酵 . 9 酵液的离心过滤 . 9 酵液的絮凝浓缩 . 10 相法提取 白质晶体 . 10 电点沉淀法提取 白质 . 11 t 蛋白质及其晶体的 . 11 2 结果与分析 . 11 t 酵特性 . 11 酵液中芽孢数 . 11 t 酵液离心过滤研究 . 12 t 酵液的絮凝浓缩工艺条件 . 14 电点沉淀法和两相法提取蛋白质纯度比较 . 16 3 小结与讨论 . 17 结 . 17 论 . 17 第三章 虫蛋白的肠溶式微胶囊制备工艺研究 . 19 前言 . 19 1 材料与方法 . 19 试材料 . 19 相乳液法制备微胶囊工艺流程 . 19 2006 级农药学硕士学位论文 V 相乳液法制备 胶囊不同保护性胶体的选择 . 19 白质包裹量测定方法的研究 . 20 胶作分散质肠溶式微胶囊制备工艺的研究 . 23 甲基纤维素钠作分散质肠溶式微胶囊制备工艺的研究 . 24 胶囊形状观察及释放特性研究 . 24 2 结 果与分析 . 24 护性胶体物质的选择 . 24 定 胶囊包裹率方法的确定 . 25 胶作分散质微胶囊 制备工艺选择 . 28 分散质微胶囊制备工艺条件 . 31 胶囊释放特性研究 . 33 3 小结与 讨论 . 36 结 . 36 论 . 36 第四章 虫蛋白非肠溶性微胶囊的制备 . 38 前言 . 38 1 材料与方法 . 38 试材料 . 38 合凝聚法制备 虫蛋白明胶 . 38 t 杀虫蛋白的乙基纤维素微胶囊的制备 . 38 2 结果与分析 . 39 胶 . 39 基纤维素微胶囊的形状及释放特性 . 40 3 小结与讨论 . 42 结 . 42 论 . 42 第五章 总结与展望 . 44 1 总结 . 44 2 展望 . 44 参考文献 . 46 个人简历 . 53 致 谢 . 53 2006 级农药学硕士学位论文 文摘要 摘要 ：本研究对生物农药苏云金芽孢杆菌进行了 气升式发酵 ,研究了 发酵液的 离心过滤 工艺条件 ,壳聚糖 絮凝 浓缩 工艺条件 ,复相乳液法制备 虫蛋白 肠溶 微胶囊的最佳工艺条件 ,羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯 (白质微胶囊包裹量的测定方法 ,杀虫蛋白的非肠溶性微胶囊 ,肠溶性微胶囊和非肠溶性微胶囊的释放特性等。 气升式发酵得到了晶体规则 ,数量多的发酵原液 ； 离心过滤可以除去发酵原液中的大颗粒物质 ,有利于后续分离纯化工艺的进行 ,其最佳工艺条件为 在每次处理量 1L,温度 10、 过滤效果最好 ； 采用壳聚糖进行絮凝浓缩 ,避免了化学絮凝剂 、 微生物絮凝剂对原药效果的影响 ,絮凝浓缩可除去约 75%左右的水分及有色物质 ,其最佳工艺条件为 ： 度 30、搅拌时间 5550r/通过对发酵液分离纯化 ,得到 等电点沉淀法提取的 杀虫 蛋白质比有机溶剂法的纯度高。 对测定 白质微胶囊包裹量的方法研究中得到福林 定 ； 复相乳液法制备的肠溶式微胶囊形态多为圆形 ,并且没有粘结在一起的现象 ,最佳工艺条件为 ： 分散质浓度为 搅拌转速 6000r/壁材料浓度 2%乳化剂用量为 5%、芯材量 4%、分散比为 1:以乙基纤维素制备的非肠溶性微胶囊形态规则 ,不粘结在一起 ,通过对微胶囊释放特性研究得到 ： 体外测定2时 微胶囊 释放量达到平衡 ,肠溶性微胶囊在偏碱性环境中释放速度快 , 而非肠溶性微胶囊则不受溶液的酸碱性影响 。 关键词 : 苏云金芽孢杆菌 絮凝浓缩 杀虫蛋白 微胶囊 2006 级农药学硕士学位论文 文摘要 of it by of of as t of of t of or in of by of t 1 L 0、 It of or on if as 5% or 0, 50r/ By t, it by of by 000r/% %, %, :of By of it in to in in in 006 级农药学硕士学位论文 1 第一章 综述 生物农药是指用来防治病、虫、草等有害生物的生物活体及其代谢产物和转基因产物 ,并可制成 商品的生物源制剂包括细菌、病毒、真菌、线虫、植物、昆虫天敌、农用抗生素、植物生长调节剂和抗病虫草害的转基因植物等 1。 1 苏云金芽孢杆菌研究进展 苏云金芽孢杆菌（ 是重要的生物农药 。 1957 年苏云金杆菌制剂首次上市销售 ,目前商品制剂已达 100 多种 ,是世界上产量最大 ,应用最广的微生物杀虫剂 2。分离的 种已达 70 个 H 血清型 ,83 个亚种 ,剂产量占所有活体微生物杀虫剂的比例达 90%以上 3。 云金芽孢杆菌杀虫机理 杀虫活性物质包括伴孢 晶体、芽孢、 稳定外毒素及水溶性外毒素等 4。其中伴孢晶体是 虫活性的主要来源 ,也是目前研究较多的 虫活性物质。一般认为 孢晶体的杀虫机理是：伴孢晶体被敏感昆虫取食后 ,在昆虫中肠内溶解为前毒素 ,再经中肠蛋白酶水解形成具有杀虫活性的毒性肽 ,毒性肽穿过围食膜 ,与中肠上皮细胞刷状缘膜的结合 ,并进一步插入膜内 ,形成孔洞或离子通道 ,引起离子渗漏 ,破坏肠壁上皮细胞 ,使肠道内溶物渗入血腔 ,引起败血症 ,从而造成昆虫全身麻痹而死 5。芽孢是 酵的主要产物之一 ,生物产量大 。它通过具有类似晶体毒素作用的芽孢衣蛋白和本身萌发时对昆虫肠壁造成的穿透作用 ,可提高伴孢晶体的杀虫效果。其余 虫物质也以各自的作用方式起到一定的杀虫作用 6。 云金芽孢杆菌增效措施的研究进展 效菌株的筛选 通过从土壤、植物叶面等来分离优良的 株 ,包括生长、产蛋白晶体、抗紫外 以及通过基因工程改良 等 方面 。 酵方面的改进 通过优化培养基配方、改换先进的发酵设备、改善发酵条件可以提高生产水平。在培养基优化选择上得到 一 ,含糖 糖氮比 7。在氮源的选择上 ,8,常用的有豆饼粉、玉米浆、鱼粉 ,酵母浸膏、棉籽饼粉等。在碳源的选择上 ,玉米淀粉 ,葡萄糖 ,因为在生长过程中能分泌活跃的胞外淀粉酶所以选择淀粉比较好 9,一是可以降低成本 ,二是减免了葡萄糖在高温灭2006 级农药学硕士学位论文 2 菌时的焦化问题 ,但是加入适量的葡萄糖可以促进菌体在发酵刚开始的生长。在碳氮比方面 ,报道的不同苏云金亚种文献差别较大 ,但是一般控制在 C/0。为了降低培养基的成本 ,现 在有采用食品工业废水来进行发酵 建州等通过味精废水对 得到 在发酵罐和摇瓶机里对经过预处理后的味精废母液进行的对比发酵研究表明 ,添加少量营养物质就可基本达到在正常培养基中 11。但与采用正常培养基的发酵过程相比、苏云金芽孢杆菌在味精废水中的发酵周期有所延长。章克昌等利用酒糟废液培养苏云金杆菌 ,经过对废水预处理、菌种驯化、发酵配方的优化 探讨了一条经济可行的工艺路线 ,具有较高的工业应用价值 12。 发酵设备方面 ,现在发酵 泡式和气升式反应器等几种 类型。其中搅拌式反应器有剪切力大 ,易污染以及高能耗的缺点。 西北大学现代分离科学研究所的李君、申烨华等人用环隙气升式内环流反应器与机械搅拌罐进行了发酵对比实验 ,结果表明 ,环隙气升式内环流反应器优于机械搅罐 ,不仅发酵周期缩短了 7h,而且菌数提高了 13。笔者采用气升式反应器和气升 发现通气量相同时 ,气升 发酵时间缩短了 10个小时 ,本试验室气升 液面上部搅拌的方式很大程度上满足了菌体对氧气的需求 ,并且上 部搅拌极大程度上减小了搅拌器的剪切力。 在工艺操作方面 ,流加式补充培养基或其中某种成分可以极大的提高发酵水平 1415；在发酵初期 ,在发酵对数期大的通气量有利于菌体的生长 ,在衰退期 ,小的通气量有利于蛋白质晶体的产生；温度在 30 是 养基初始 但 不同的亚种最佳 游技术 改进 是 将伴孢晶体等杀虫成分及其增效因子与发酵液分离 ,去除占质量 90 以上的水分 ,得到干燥的工业原粉 16。因此 ,工业化后加工技术是影响成本的重要因素。 t 发酵液的浓缩方法 通过膜过滤技术可对 锦泉等应用超滤技术分离 排除水分 83%,发酵液浓缩达 5 7倍 ,超滤通量为 22L/(m2h),孢子截留率达 100%17。阮传清等研究了 500种不同孔径分子筛对 结果表明 9种规格孔径的分子筛晶体和芽孢的回收率为 超滤液通量随着膜孔径增大而增大。发酵液固形物含量越低 ,分离时间越短、浓缩比越高。当固形物含量在 ,分离 时间为 20 缩比为 固形物含量为 15%时 ,分离时间延长到 69缩比降为 8。使用膜过滤法一般花费时间较长 ,代价高。 2006 级农药学硕士学位论文 3 通过加入絮凝剂 ,可以对发酵液进行絮凝浓缩。对 其中的固形物会沉淀下来 ,但是酸性环境会造成效价的损失。王涛采用明矾部分或全部代替盐酸调节苏云金芽孢杆菌发酵液的 对杀虫活性成分进行了絮凝浓缩19。 常用的絮凝剂中 ,无机的阳离子絮凝剂多为聚合铁盐或者铝盐 ,人工合成的阳离子絮凝剂应用最多的是聚丙烯酰胺（ 20,它们相比 天然的有机絮凝剂最大的缺点是易污染蛋白质。 与无机或有机合成高分子絮凝剂相比 ,微生物絮凝剂具有许多特点 ,如高效、无毒、可消除二次污染、絮凝广泛、脱色效果独特等 21,但是因为其自身代谢需要及产物的影响 ,不适合絮凝 此寻找一种无毒 ,生物相容性好的絮凝剂是絮凝浓缩工艺中的重要步骤。壳聚糖作为一种天然的阳离子吸附剂 ,本身无毒、无味 ,不会造成二次污染 ,是絮凝和回收蛋白质的理想絮凝剂 22。笔者以壳聚糖作为絮凝剂用来对 研究了发酵液 度、壳聚糖使用浓度、絮凝前搅拌时间和搅拌速 度等因子对絮凝效率的影响 ,结果得到 ,通过壳聚糖对 可以除去大部分水分及有色杂质等 , 405%左右的水分 ,并且显微镜观察在上清液中很少或 不存在 其最大的优点是操作简便、处理量大、不需要昂贵的设备和特殊的试剂 ,在发酵液后处理工艺中具有广泛的应用前景。 离心分离法是目前苏云金芽孢杆菌大规模生产中应用最广的方法 ,但是其中的增效物质不能够得到收集而流失 23。 但是 ,是否可以在离心后 ,对上清液进行减压浓缩 24或者膜过滤 25收集 ,然后研究两者的配比对效价 的影响从而获得高效价的 在浓缩方法中 ,还有板框压滤法 26,减压浓缩法以及其他新型的方法 ,但整体来看 ,通过絮凝沉降来浓缩发酵液应用在工业生产是比较可行的。 效剂的选择 存在杀虫谱较窄、杀虫速率慢、易受紫外线损伤而迅速失效等问题 ,为了克服这些缺点 ,国内外许多学者都在研究 、盐、锌盐、铜盐、硼酸、单宁酸等增加了 生物活性 2728。阿地力 沙塔尔等通过向精、维生素 以上这些物质在一定的浓度范围内 ,均有不同程度的刺激昆虫取食及提高 9。黄勤清等研究了助剂 101、 6501、 1227A、 润性以及杀虫效果的影响 ,结果表明 ,所有助剂均能不同程度提高 其中 01和 不但可显著提高湿润性 ,而且杀虫增效倍数分别达 0。 宋健等对苏云金 芽孢杆菌 株增效剂的初步筛选得到 , 无机类：,),),)等三种物质有显著的2006 级农药学硕士学位论文 4 增效作用；有机类：柠檬酸 (,)对 31。邱思鑫等研究了添加剂对苏云金杆菌发酵液杀虫效果的影响 ,筛选出 12种有较好增效作用的物质进行不同浓度对 各添加剂的浓度对 在 10g 强。添加剂 2号、碳酸钾、硼酸 等 物质的增效作用明显 ,增效倍数分别达 乙酸钙、乙酸钠、硫酸亚铁等9种物质的增效倍数达 32。 在实际生产中 ,相同的增效剂可能对不同的菌株增效作用不同 ,需根据不同 2 微生物农药剂型 及微胶囊剂型的 研究进展 生物农药剂型介绍 近年来 ,新农药的开发难度不断增大 , 成功率明显下降 , 成本大幅度上升 ,因此 ,大多数的农药生产厂家都将农药研究的重点转移到加工制剂的改 进上 33。在生物农药研究中 ,研究最多的是微生物农药。目前 ,微生物农药发展的主要方向是微乳剂、乳剂、悬浮剂等 ,其次还有水剂、油悬剂、油烟雾剂、可湿性粉剂、水分散性颗粒剂、悬浮剂颗剂、漂浮块剂、紫外线防护剂型、微胶囊剂和微球等。 乳剂和水乳剂 一种 或一种以上液体以液珠的形式均匀地分散在另一种互不相溶液体中形成的分散体系称为乳状液 (态或固态农药原药的溶液 ,在表面活性剂等助剂的作用下 ,以微小液滴分散在水中 ,形成稳定地水包油型的乳状液 ,当液滴的直径在 匀液体称为微乳剂；当液滴直径在 34。程萌等研究了阿维 高效氯氟氰菊酯 乳剂 ,并通过田间药效试验得到 ,该微乳剂 1567药后 10d 20667量杀虫效果达 97以上 35。陈列忠等将阿维菌素和氯氰菊酯、甲氰菊酯、三氯氟氰菊酯复配成了微乳剂 ,并分析该制剂的特点、社会效益及推广前景。此外 ,还有 臼毒素微乳剂、 臼毒素 三氟氯氰菊酯微乳剂 36,印楝 素微乳剂 37。刘明炎等研究了 2000 l 乳剂防治灰茶尺蠖 ,室内试验结果 ,80倍 防治 1田间试验 70倍 防治 14幼虫效果在 80左右； 防治 138。 微乳剂和水乳剂都是以水作为主要溶剂 ,闪点高 ,不燃不爆 ,对环境的污染小 ,相容性好 ,降低了使用量和使用成本 ,是未来农药发展的主要方向。 浮剂 悬浮剂是一种发展中的、环境相容好的农药新剂型 ,是将水不溶性农药原药2006 级农药学硕士学位论文 5 在助剂作用下经湿法粉碎或均质分散在水相介质中形成的极小油珠或微粒 的悬浮体系 39。生物农药悬浮剂型有 0,白僵菌 41,阿楝 42),尺蠖清 43等。悬浮剂的特点是水基化、使用安全、方便 ,有超过可湿性粉剂的市场潜力。然而 ,悬浮剂为非均相液体 ,在重力场中存在着固有的动力学不稳定性 ,具体表现为产品在贮存过程中 ,液体发生分层、沉淀、结饼现象 44。 悬剂 油悬剂是指一类用经过试验可以作为菌剂助剂且不污染作物的油类作为载体的一种剂型 ,油类包括植物油或矿物油作为稀释剂 ,要求油类本身具有良好的粘着性和展着性 ,容易粘附于蜡质或光滑的叶面所以油剂具有粘着 性和展着性、抗雨冲刷能力强等优点 45。生物农药油悬剂主要有阿维菌素 46、 7等 ,此外世玛油悬剂也较多。 油悬剂的缺点是使用大量的油类 ,成本高 ,油类黏附在作物液面 ,造成部分液面部分气孔的堵塞 ,影响植物光合作用和呼吸作用的进行 ,并且收获期短的作物如果使用油悬剂 ,残存在上面的油类会影响农产品的色泽和品质。 胶囊剂 型研究进展 微胶囊技术是采用天然或合成高分子材料通过化学法、物理法或物理化学法将另一种物质包裹起来形成一种具有半透性或密封囊膜的微型胶囊的技术。微胶囊化不仅提高了产品价值 ,而且增加了具有极大价值的产品种类 48。微胶囊技术的研究起源于 21954年美国 司的B K 并将该技术应用于无碳复写纸的生产 49。现在 ,微胶囊技术的应用范围已从最初的药物包覆和无碳复写纸扩展到医药、食品、农药、饲料、涂料、油墨、粘合剂、化妆品、洗涤剂、感光材料、纺织、阻燃剂、除雾剂、电解质等各个行业 ,取得广泛的应用 50。 胶囊的壁材 微胶囊的壁材选择对微胶囊产品的性能 起到决定性的作用。用于制作微胶囊壁材的材料常为高分子物质 ,根据其来源可以分为 ,天然的、半合成的和全合成的高分子材料。 天然的微胶囊壁材主要包括碳水化合物类如淀粉、乳糖、纤维素、壳聚糖及其他一些多糖的等；蛋白质类明胶、大豆蛋白、玉米蛋白等；脂类有石蜡、蜂蜡、硬脂酸等。另外 ,还有淀粉的一些深加工产品如环糊精、麦芽糊精与淀粉糖浆、多孔淀粉、烯基琥珀酸淀粉酯、羧甲基淀粉、抗性淀粉等 51。其中 ,明胶和阿拉伯胶是最常用的微胶囊。王广远等以明胶和阿拉伯胶为囊材 ,甲拌磷为芯料 ,采用复合凝聚法制备出甲拌磷微胶囊剂应用于农 药 ,减低了农药在作物环境中降解的速度 ,较好地掩蔽了农药的臭味 ,减少了农药对人体的危害和环境的污染 52。朱2006 级农药学硕士学位论文 6 丽云等以明胶一阿拉伯胶为囊壁材料的复凝聚相分离法制备 结果得到制备的 53。 Y. 用淀粉制成的 延长残效期 54。 天然高分子材料具有无毒或毒性很小、不需大量的有机溶剂、对环境危害小、粘度大、易成膜的特点 ,但机械强度差 55。 半合成的囊壁材料主要是一些纤维素 衍生物如乙基纤维素 (羧甲基纤维素钠（ 邻苯二甲酸醋纤维（ 羟丙甲基纤维素邻苯二甲酸脂(；变性淀粉如 辛烯基琥珀酸淀粉酯、氧化淀粉、硬酯酸淀粉酯、羧甲基淀粉等 56；另外还有长链化合物、脂肪醇衍生物等 57。 乙酸丁酸纤维素 (壁材 ,O ,制备了其微胶囊 58。笔者采用 利用复相乳液法制备了 全合成的囊壁材料主要有聚酰胺、聚酯、聚氨酯、聚脲、及烯类共聚物等。等用异氰酸酯、聚苯乙烯及环丁烷三胺作为壁材 ,采用界面聚合法制备了毒死蜱微胶囊 ,得到生成的微胶囊粒径范围较窄 ,粒径和壁厚均匀 ,释放速率恒定 59。江定心等采用 3:4(m:m)的甲苯 六亚甲基四胺为壁材 ,芯材与壁材的配比为 30:7(m:m),溶剂采用 3:2(m:m)的乙酸乙酯和二甲苯混合溶剂比效适 宜 ,微胶囊中印楝素的包埋率为 (。所制得的印楝素微胶囊剂通过盆栽试验表明 ,对昆虫具有较好的防治效果和较长的持效期 60。周菁等优化了用尿素 ,甲醛树脂作为壁材 ,原位聚合法制备阿维菌素微胶囊工艺条件 ,得到 ,加入适量的 当升高反应温度 ,控制加酸速度等制备出的阿维菌素微胶囊的外观形貌、粒径 、 均匀度等都有明显改善 51。 此外 ,还有无机的微胶囊壁材 ,如碳酸钙、 陶瓷粉等。它们有不同与有机类的特点 ,国内研究的较少。 胶囊的制备方法 微胶囊制备方法大致可分为 3类 ,即 化学法、物理法和物理化学法。化学法一般包括界面聚合法、锐孔一凝固浴法、乳液聚合法、原位聚合法等；物理法有喷雾法、空气悬浮法、锅包法、包结络合法等；物理化学法有复凝聚法、油相分离法、单凝聚法、干燥浴法 (复相乳化法 )、熔化分散冷凝法等 62。在微胶囊的制备 过程中 ,不断有新的方法出现 ,如微孔分散法、超临界流体快速膨胀法 、气体饱和溶液法、超临界流体抗溶剂结晶法等。 在具体的微胶囊制备中 ,选择何种材料以