【毕业学位论文】(Word原稿)短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX功能成分羟苯乙酯含量测定及其生产发酵条件优化-生物化学与分子生物学

分类号 : 单位代码 : 10389 密 级 : 学 号 :1101652 福建农林大学硕士学位论文 短短芽胞杆菌 能成分 羟苯乙酯含量测定及其生产 发酵条件 优化 学 科 门 类 :理学 一级学科名称 :生物学 二级学科名称 :生物化学与分子生物学 研 究 方 向 :微生物分子生物学 研 究 生 : 指 导 教 师 : 教 授 研 究 员 副研究员 完 成 时 间 :二 of in C P 2013 福建农林大学硕士学位论文 独创性声明 本人声明，所呈交的学位（毕业）论文，是本人在指导教师的指导下独立完成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 学位（毕业）论文作者亲笔签名 : 日期 : 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学有关保 留、使用学位（毕业）论文的规定，即学校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅； 学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密，在 年后解密可适用本授权书。 不保密，本论文属于不保密。 学位（毕业）论文作者亲笔签名 : 日期 : 指导教师亲笔签名 : 日期 福建农林大学 硕士学位论文 3 目 录 目 录 . 3 中文摘要 . 1 第一章 文献综述 . 1 1 尼泊金酯概述 . 1 泊金酯的应用概况 . 1 泊金酯的理化性质 . 2 泊金酯的作用机理 . 2 2 固相萃取技术 . 3 相萃取原理 . 3 相萃取分类 . 4 相萃取一般步骤 . 5 3 色谱技术技术及其应用 . 6 效液相色谱法概述 . 6 效液相 色谱法的特点 . 6 4 本研究试验设计依据 . 7 因素轮换优化设计 . 7 验设计 . 8 陡爬坡路径法 . 8 应面分析法 . 8 5 本研究的目的与意义 . 9 第二章 固相萃取 酵液中羟苯乙酯的含量 . 10 1 材料与方法 . 10 料 . 10 株 . 10 养基 . 10 要仪器设备 . 10 验方法 . 10 品制备 . 10 谱条件 . 11 体发酵条件 . 11 测方法 . 11 准曲线测定试验 . 11 统适应性试验 . 11 密度试验 . 11 低检测限 . 12 定性研究 . 12 福建农林大学硕士学位论文 4 收率试验 . 12 2 结果与分析 . 12 动相选择 . 12 动相为甲醇 醋酸 . 12 动相为甲醇 . 15 动相为乙腈 . 16 动相为乙腈 酸铵 . 17 测波长的选择 . 19 准曲线的线性范围研究 . 19 统适应性试验 . 19 密度试验 . 20 低检测限度 . 20 定性研究 . 20 收率试验 . 20 品测定 . 21 3 结果与讨论 . 21 第三章 响应面优化短短芽胞杆菌 酵液中羟苯乙酯含量 . 22 1 材料与方法 . 22 料 . 22 株 . 22 养基 . 22 要仪器设备 . 22 验方法 . 22 苯乙酯含量测定 . 22 体干重 . 23 体发酵条件 . 23 因素优化 . 23 验 . 23 陡爬坡试验 . 23 应面分析 . 24 证试验 . 24 2 结果与分析 . 24 因素优化 . 24 同碳源的发酵培养基产羟苯乙酯的影响 . 24 同氮源的发酵培养基产羟苯乙酯的影响 . 24 同无机盐的发酵培养基产羟苯乙酯的影响 . 25 酵主要影响因子的筛选 . 25 陡爬坡路径试验确定重要影响因子的最适浓度 范围 . 27 应面分析优化（ 养基组成 . 28 验设计与结果 . 28 福建农林大学 硕士学位论文 5 次响应面回归模型的 建立 . 29 次响应回归模型的评价 . 29 次回归模型的脊岭分析 . 30 养基组分最适浓度的获 取 . 32 归模型的验证 . 32 3 讨论 . 32 参考文献 . 34 个人简历 . 38 致 谢 . 39 福建农林大学 硕士学位论文 1 中文摘要 短短芽胞杆菌 （ 本实验室自土壤中分离的对多种病原菌具有抗菌活性，可以抑制青枯雷尔氏菌 、大肠杆菌等细菌的生长，也可以抑制尖刀廉胞菌等真菌 的生长。本实验建立了固相萃取 酵代谢产物羟苯乙酯，响应面优化发酵条件 。 首先 建立了固相萃取 品发酵液经过 相萃取小柱，经过 谱柱进行测定。流动相为甲醇 积比为 65:35），流速 1.0 mL/测波长为 254 定温度为 25 ，进样量 10 L 。羟苯乙酯的线性范围为 ， r=收率为 平均 该方法最低检测为 10S/N=6）。该方法操作简便、快速、准确、灵敏度高、重现性好，可用于发酵中羟苯乙酯含量的检测。 其次进行发酵培养基优化，通过单因素筛选确定最佳碳源为葡萄糖 源为蛋白胨，最佳金属离子为 采用二水平 计对影响毒力的 8 因素进行显著性筛选，获得培养基成分中 3 个重要影响因子 :豆饼粉、 用爬坡路径法对这 3 种因子进行试验，获得 3 种重要因子的最适浓度范围；通过响应面分析法得到 3 个重要因子的 交互作用和最佳条件 :豆饼粉 g/L、 g/L、g/L 、蛋白胨 2 g/L 、温度 35 0C、接种量 2 %、通气量 100/250 速 170 化结果与实际实验结果吻合较好， 较基础发酵培养基（ mg/高了 。说明响应面设计分析较成功地应用于本培养基优化试验。发酵培养基的优化对菌种的优化非常重要，本研究结果对该菌株的工业发酵和羟苯乙酯的生产具有重要意义。 关键词：短短芽胞杆菌、固相萃取、高效液相色谱、羟 苯乙酯、发酵； 福建农林大学 硕士学位论文 1 第一章 文献综述 1 尼泊金酯概述 泊金酯的应用概况 尼泊金酯于上世纪 20 年代首次报道了其抗菌活性。经过十几年的研究， 1923 年尼泊金酯类就被建议作为食品和药品的防腐剂。由于尼泊尔金酯毒性低，抑菌作用与 菌谱广（周家华， 2001），广泛应用于食品、医药、日用品、化妆品等许多领域，仅在化妆品行业全国每年需求量就达 50t 以上。尼泊金乙酯和丙酯也是世界上用量较大的防腐剂，它具有高效、低毒、广谱、易复配的优点。尼泊金酯除对真菌有效外，由于它具有酚羟基结构，所以抗细菌性能比 苯甲酸、山梨酸都强。但是，由于尼泊金酯的水溶性比较低，用量过大时具有特殊的气味，使其在食品防腐上的应用受到限制。我同在五、六十年代也曾经把尼泊金酯作为主要的食品防腐剂，由于水溶性的问题没有得到很好解决，加上苯甲酸钠的大量生产，尼泊金酯在食品工业中作为防腐剂使用的量越来越小，到八十年代，尼泊金酯主要用作药品和化妆品，特别是化妆品的防腐剂，九十年代以后，随着改革开放的不断深化，特别是加入 ，我国跟国际的接触越来越广，食品生产必须与国际接轨，食品安全性也越来越受到人们的重视。我国明确规定 用苯甲酸和苯甲酸钠作为食品防腐剂（许文苑，林海禄，熊国宣，彭雪娇， 2002）。 世界上许多国家和地区把尼泊金酯和尼泊金酯钠作为食品防腐剂，美国、日本、欧洲、加拿大、澳大利亚、韩国等发达国家都允许尼泊金酯和尼泊金酯钠在食品工业中应用。目前，尼泊金酯和尼泊金酯钠已在焙烤食品、脂肪制品、乳制品、水产品、肉制品、调味品、胞制品、酱制品、饮料、糖果、果蔬制品、淀粉糖制品、啤酒、果酒、果蔬保鲜及制药、化妆品与饲料等多个领域得到广泛应用（孙晓云， 1986；林日高，林捷，周爱梅，廖北科，陈永泉， 2002）。我国也把尼泊金 乙酯和尼泊金丙酯列为食品防腐剂，应用于酱油、醋、饮料、水果、蔬菜、果汁、果酱等行业（段杉，彭喜春，彭志英， 2002）。 食品防腐剂的主要发展趋势之一是品种多样化，使用微量化和应用技术制剂化。从尼泊金酯的分子结构看，既有亲水活性基团羟基，通过适当的改性，可以大幅度增加尼泊金酯的水溶性，彻底改变尼泊金酯不溶于水这一缺陷。另外，利用不同链长烷基醇可以生产系列产品，特别是长链尼泊金酯系列产品。而尼泊金酯类系列产品间的复配，特别是长短链的搭配，可以复配出适用于各类食品的专用防腐剂，这些都是其它类食品防腐剂所难以达到的 。因此，尼泊金酯类生产技术今后主要发展趋势为产品系列化，特别是长烷基链尼泊金酯类的开发研究，而这些产品的开发又能使食品防腐剂使用微量化；其次是产品改性技术和复配技术的研究，提高产品的水溶性和稳定性，增强抑菌效果，使产品使用制剂化和专业化。 目前对羟基苯甲酸酯类物质进行定量检测主要方法有超声萃取液相色谱法、具氢火福建农林大学硕士学位论文 2 焰离子化检测器的气相色谱法、毛细管气相色谱法、液相色谱 此之外还有生物传感器、红外光谱法等。利用这些比较精确的分析方法对食品中的尼泊金酯类防腐剂进行定性、定量测定，严格限制此类防腐剂的最 大添加量以尽量降低其对人体所产生的毒副作用。 泊金酯的理化性质 尼泊金酯为无色结晶或白色粉末包括对羟基苯甲酸甲酯（ 对羟基苯甲酸乙酯（ 对羟基苯甲酸丙酯（ 对羟基苯甲、对羟基苯甲酸丁酯（ ，具体理化性质见表 1 尼泊金酯是类酯化合物，无挥发性，受 的影响小。其化学性质稳定， 在 酸性、碱性和中性溶液中均有较好的防腐效果，尤其在酸性溶液中的防腐效果最好（赵万 详，1982）。因其 用范围广、杀菌性能稳定而在果蔬、酱油、水果汁等食品和化妆品中应用广泛（ 张群林 ， 刘丽娟 ， 崔华 ， 2006）。 表 1泊金酯主要理化性质 of 称 分子式 分子量 在水中溶解 度 (g/100g) 在乙醇中溶解 度 (g/100g) 在丙酮中溶解（ g/100g) 外观 对羟基苯甲酸甲酯 52 2 64 无色结晶或白色粉末，无味、无嗅、口尝有麻舌感 对羟基苯甲酸乙 酯 0 84 无色结晶或白色粉末，无味、无嗅、口尝有麻舌感 对羟基苯甲酸丙酯 5 105 无色结晶或白色粉末，无味、无嗅、口尝有麻舌感 对羟基苯甲酸丁酯 10 240 无色结晶或白色粉末，无味、无嗅、口尝有麻舌感 泊金酯的作用机理 尼泊金酯类的抑菌机理是破坏微生物的细胞膜，使细胞内的蛋白质变性，并抑制电子传递酶系的活性和细胞的呼吸酶系。基团空间位阻是抗菌活性中心 发挥抗菌活性的第一限制性因素（袁海涛，芮汉明，宁正祥， 2001）。尼泊金酯的抗菌活性主要是由分子态起作用，由于分子内的羧基已被酯化，不再电离，而对位羟基的电离常数却很小，在溶液 为 8 时，仍有 60%以上呈分子状态存在，结果见表 1 1寿清， 2003）。因此，尼泊金酯的抑菌作用在 宽的范围内均有良好的效果（宋国胜，郭祀远，蔡妙颜，郑必胜， 2002，陈效贵， 2001）。微生物在食品体系中仅仅出现在水相中，一切福建农林大学 硕士学位论文 3 与生命活动相关的酶促生化反应也均在水相中进行，进入酯相的防腐剂被认为是无效的，防 腐剂主要是通过抑制微生物的能量代谢，造成能量物质 还原力 亏缺，代谢方向趋于水解，最后导致细胞自溶而发挥抑菌作用。因此，防腐剂分子必须具备亲水基团才能进入相中的菌体中，与合成代谢酶系统起作用。 表 1泊金酯在溶液中的电离状况 of in 称 尼泊甲酯 尼泊乙酯 尼泊丙酯 尼泊丁酯 a 109 1-3 尼泊尔金酯在溶液中分子态的影响 of pH on of in 泊甲酯 尼泊乙酯 尼泊丙酯 尼泊丁酯 3 100 100 100 100 4 00 100 5 物系统是微生物进行能量转化和物质代谢等生命活动的主要场所，其结构的完整性保证了对物质选择透过性和细胞能量代谢等生命活动的正常进行。防腐剂分子中的疏水基团具有易溶于生物膜相且能够动态踞留于生物膜相，结果一方面破坏了细胞膜的结构，扰乱了微生物的正常生命活动，另一方面由于生物膜中的脂溶性成分代谢速率较低，不易被微生物自身的酶系分解，延长了防腐剂的抑菌时间 。因此，防腐剂分子必须同时具备易溶于生物膜相的疏水基团和亲水基团。其透过细胞壁进入菌体的能力与水相中的溶解度息息相关，防腐剂的抑菌性则取决于防腐剂在菌体细胞双磷脂层中的溶解度。尼泊金酯的烷基酯链越长，抑菌效果越好。说明疏水基团中的存在可以增强防腐剂分子的抑菌效果。 2 固相萃取技术 相萃取原理 固相萃取（ 一个包括液相和固相的物理萃取过程，是福建农林大学硕士学位论文 4 基于液相色谱理论的一种分离、纯化方法，由液固萃取和液相柱色谱技术结合发展而来。其吸附剂即为固相，通过固相 萃取剂对液相中被分析物的吸附作用进行萃取，当样品溶液通过萃取剂时，被分析物就吸附到萃取剂上，然后采用适宜的选择性溶剂将其洗脱下来，即可得到富集和纯化了的目标化合物。 术自上世纪 70 年代后期问世以来，以其高效、可靠及耗用溶剂量少等优点，在环境、药物分析等许多领域得到了快速的发展（ ， W， 2006；2000； G， 1993） 。传统的液一液萃取 （ 具有易产生乳化、杂质较多、回收率低、需要的样品量大等缺点。与传统的 液液萃取相比较， 有富集倍数高、提取速度快、操作简便、溶剂使用量少等优点，是目前样品处理技术简便、高效、灵活的一种手段（ 1997） 。 一个柱色谱分离过程，分离机理、固相和溶剂的选择等方面与 许多相似之处。 基本原理是分析物在两相之间的分配，即在固相和液相之间的分配。其保留或洗脱的机制取决于分析物与吸附剂表面的活性基团，以及被分析物与液相之间的分子间作用力。有两种洗脱模式，一种是被分析物比所存在的生物介质与固相之间的亲和力更强，因而被保 留，然后用一种对被分析物亲和力更强的溶剂洗脱；另一种是存在的生物介质较被分析物与固相之间亲和力更强，则被分析物直接被洗脱。通常使用的为前一种模式。 相萃取分类 根据所分析物与固相萃取填料的相互作用机制不同，可将固相萃取法分为三类 :正相、反相和离子交换固相萃取。 （ 1）反相固相萃取 硅胶填料表面的亲水性硅羟基通过硅烷化反应，键合非极性烷基、芳香基或聚合物等材料作