PCR技术及其应用ppt课件

PCR技术及其应用 生物化学实验技术 目录 PCR的反应原理PCR的类型和应用PCR示例 多聚酶链式反应 PCR PolymeraseChainReaction KaryB Mullis PCR是由美国科学家穆利斯提出的一种体外简化条件下模拟DNA体内复制的DNA快速扩增的方法 此技术获得1993年诺贝尔化学奖 体内DNA的复制体系 DNA聚合酶 IIIIII 拓扑异构酶解旋酶类SSB 引物dNTPMg2 Mullis的PCR构思 TaqDNA聚合酶 thermusaquaticus 酶活性 温度 405060708090100 10080604020 耐热DNA聚合酶 Saiki 1988 将耐热DNA聚合酶引入PCR 使利用热变性解链DNA模板可行 PCR反应循环 PCR的指数扩增 2n 引物 延伸 延伸 5 5 3 3 变性 退火 变性 退火 变性 退火 延伸 Taq P1 P2 PCR反应体系 dATP dTTP dGTP dCTP Mg2 模板 DNA引物 P1 P2DNA聚合酶 TaqE原料 dNTP反应缓冲液10 xBuffer辅助因子 Mg2 1 PCR反应成分 1 模板单 双链DNA均可 不能混有蛋白酶 核酸酶 DNA聚合酶抑制剂 DNA结合蛋白类 DNA模板一般100ng 100 L 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加 PCR反应条件 2 引物浓度0 1 0 5 mol L浓度过高易导致模板与引物错配 反应特异性下降 3 TaqDNA聚合酶0 5 2 5U 50 l酶量增加使反应特异性下降 酶量过少影响反应产量 4 dNTP 10mMor2 5mM 含四种核苷酸dATP dGTP dCTP dTTPdNTP浓度取决于扩增片段的长度浓度过高易产生错误碱基的掺入 浓度过低则降低反应产量dNTP可与Mg2 结合 使游离的Mg2 浓度下降 影响DNA聚合酶的活性 5 Mg2 Mg2 是DNA聚合酶的激活剂 浓度为0 5 2 5mmol L Mg2 浓度过低会使Taq酶活性丧失 PCR产量下降 Mg2 过高影响反应特异性 Mg2 可与负离子结合 所以反应体系中dNTP EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2 浓度 2 循环参数变性使双链DNA解链为单链94 30 60秒 2 退火温度由引物长度和GC含量决定 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合 降低温度可增加反应的灵敏性 引物设计 1 序列应位于高度保守区 与非扩增区无同源序列 2 引物长度以15 40bp为宜 3 碱基尽可能随机分布 G C占40 60 4 引物内部避免形成二级结构 5 两引物间避免有互补序列 6 引物3 端为关键碱基 5 端无严格限制 Tm G C x4 A T x2 3 延伸70 75 一般为72 延伸时间由扩增片段长度决定 4 循环次数主要取决于模版DNA的浓度一般为25 35次次数过多 扩增效率降低错误掺入率增加 PCR的应用1 特定DNA片段 基因 调控序列 的鉴定 分离或制备 A DNAB cDNA2 基因表达分析 原位 离体 A 基因是否表达B 基因表达水平高低3 基因突变 基因克隆 逆转录酶 聚合酶 mRNA cDNA 杂交双链 PCR扩增 1 细胞或组织固定 细胞经固定和乙醇通透化处理后便适于一般PCR试剂 包括引物和Taq酶 进入2 PCR扩增细胞内目的片段3 原位杂交检测扩增产物 A 阳性对照 B 阴性对照 C 原位检测mRNA表达 原位 分析基因表达的组织特异性 荧光定量PCR real timePCR 分析基因表达水平通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针 对PCR产物进行标记跟踪 实时在线监控反应过程 结合相应的软件可以对结果进行分析 计算待测样品的初始模板量 内掺式染料SYBRGreenI序列特异性探针TaqmanMolecularBeaconsDualProbes FRET 引物特异性探针Amplifluor Intergen SYBR GreenI 反向PCR reversePCR 扩增已知序列两侧的未知序列 用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段 对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增 未知序列 未知序列 已知序列 已知序列 未知序列 未知序列 限制酶 限制酶 连接酶 实时荧光定量PCR仪 梯度PCR仪 普通PCR仪 1 材料 含0 3Kb插入片段的克隆载体2 仪器 微量移液器及吸头 PCR仪及PCR管琼脂糖凝胶电泳设备3 试剂 10XPCR反应缓冲液25mmol LMgCl210mmol LdNTP10 mol L引物1和引物2 二 实验材料 仪器和试剂 1 反应体系 50 l体系 10XPCR反应缓冲液25mmol LMgCl210mmol LdNTP10 mol L引物110 mol L引物2模板DNATaqE补充水 三 操作步骤 2 按照如下体积向PCR管中按顺序加入各试剂并混匀 三 操作步骤 10XBuffer2 5 L 10XP12 5 L 10XT2 5 L 10XE2 5 L 25 L 水12 5 L 10XP22 5 L 3 PCR扩增程序 94 5 10min 预变性 94 30S55 30S72 30S72 5 10min 后延伸 4 保温 30Cycles 屏幕显示方式 Enter 循环内第一步温度和时间 不需要拓展功能 设置循环数 后延伸保温 后延伸温度和时间 预计反应时间 程序是否保存