人教版选修1 专题5 课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段 课件（53张）.ppt

专题五 dna和蛋白质技术 课题2多聚酶链式反应扩增dna片段 自主学习 多聚酶链式反应 体外 扩增dna dna dna拷贝 80 100 双螺旋结构 双链 变性 降低 分离 双链 dna聚合酶 5 端到3 端 3 条件 1 模板 2 分别与模板dna相结合的两种 3 a t g c四种 4 dna聚合酶 5 需要稳定的 和能严格控制 的温控设备 dna 引物 脱氧核苷酸 耐热的 缓冲液 温度 90 单链 50 两种引物 单链dna 72 dna聚合酶 碱基互补 两个引物之间 指数 温度 场所 更换 微量移液器 管的侧壁 离心管底部 pcr仪 3 dna含量的测定 1 测量原理 dna在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰 峰值的大小与 有关 2 计算方法 dna含量 g ml 稀释倍数 dna含量 50 260nm的读数 思考dna分子能准确复制的原因是什么 提示 dna分子独特的双螺旋结构为复制提供了精确的模板 通过碱基互补配对 保证了复制能够准确地进行 1 dna的两条链是反向平行的 羟基末端称为3 端 磷酸基团的末端称为5 端 2 dna聚合酶只能从引物的3 端延伸dna链 因此dna合成的方向总是从子链的5 端向3 端延伸 3 pcr中的复性就是让两条彼此分离的dna链重新结合成双链 分析 pcr中的复性是让引物与dna模板结合 判断题 4 pcr反应中的缓冲液的作用就像生物体内的dna复制中内环境的作用 分析 内环境的稳态可以保证细胞的生命活动正常进行 但是生物体内的dna复制是在细胞核内进行的 5 pcr利用了dna的热变性原理 通过控制温度来控制双链的解聚与结合 6 pcr过程与细胞内的dna复制一样 都是边解旋边复制的过程 分析 pcr利用dna热变性原理 当温度升高到90 以上时 dna双螺旋结构全部打开 因此pcr过程是全解旋复制 新知解读 1 dna复制的条件 1 dna复制的条件 知识点1pcr原理与反应过程 知识贴士dna复制需要引物的原因 dna聚合酶不能从头开始合成dna 而只能从3 端延伸dna链 2 pcr技术pcr技术利用了dna的热变性原理 在80 100 的温度范围内 dna的双螺旋结构将解体 双链分开 当温度缓慢降低后 两条彼此分离的dna链又会重新结合成双链 pcr反应的条件 知识贴士pcr需要适宜但不同于细胞内dna复制的条件 比如不需要添加解旋酶 不需要添加atp 但需要添加耐热的dna聚合酶 引物以及能够人为控制温度和复制周期等 3 pcr的反应过程 变性当温度上升到90 以上时 双链dna解聚为单链 复性温度下降到50 左右 两种引物通过碱基互补配对与两条单链dna结合 延伸温度上升到72 左右 溶液中的四种脱氧核苷酸 a t c g 在dna聚合酶的作用下 根据碱基互补配对原则合成新的dna链 pcr一般要经历三十多次循环 每次循环可以分为变性 复性和延伸三步 从第二轮循环开始 上一次循环的产物也作为模板参与反应 并且由引物 延伸而成的dna单链会与引物 结合 进行dna的延伸 这样dna聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的dna序列 使这段固定长度的序列呈指数扩增 如下图所示 pcr 多聚酶链式反应 技术是一项在生物体外复制特定的dna片段的核酸合成技术 下图表示合成过程 请据图分析回答 a过程能使dna变性解旋 对该过程的原理叙述正确的是 a 该过程用到耐高温的解旋酶破坏氢键b 该过程用到限制酶破坏磷酸二酯键c 该过程不需要解旋酶的作用d 该过程与人体细胞的过程完全相同 c 典例1 变式训练1 下列操作过程的叙述中错误的是 a pcr反应中使用的微量离心管 枪头 缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌b pcr所用的缓冲液和酶应分装成小份 并在 20 储存c pcr所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后 迅速融化d 在微量离心管中添加反应成分时 每吸取一种试剂后 移液器上的吸液枪头都必须更换 c 解析 为了防止外源dna等因素的污染 pcr反应中所用的微量离心管 枪头 缓冲液及蒸馏水等 在使用前要进行高压灭菌 还要将所用的缓冲液和酶分装成小份 并且使用一次性吸液枪头 故a b d项都正确 在使用前 将pcr所需试剂从冰箱内拿出来 放在冰块上缓慢融化 则c项错误 答案为c 1 理论上dna呈指数方式扩增 若开始只有一个dna提供模板 则循环n次后有2n个 若开始有n0个dna提供模板 则循环n次后获得的子代dna数目为n0 2n个 2 dna含量的测定 dna在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰 峰值的大小与dna含量有关 可以利用dna的这一特点进行dna含量的测定 具体方法如下 知识点2pcr扩增的计算与dna含量的测定 知识贴士pcr扩增过程中的易错点 pcr过程中无解旋酶 破坏氢键需要升高温度才能打开氢键 但此时的温度还不能破坏磷酸二酯键 因此 热变性后是dna单链 并未分解成单体 复性时只是在引物和dna单链之间形成氢键 两条单链之间并未形成氢键 因此复性后 无双链dna分子形成 多聚酶链式反应 pcr 是一种体外迅速扩增dna片段的技术 请回答下列问题 1 dna的两条链是反向平行的 通常将 的末端称为5 端 当引物与dna母链通过碱基互补配对结合后 dna聚合酶就能从引物的 开始延伸dna链 2 pcr利用了dna的热变性原理解决了打开dna双链的问题 但又导致了dna聚合酶失活的问题 到20世纪80年代 科学家从一种taq细菌中分离到 它的发现和应用解决了上述问题 要将taq细菌从其他普通的微生物中分离出来 所用的培养基叫 磷酸基团 典例2 3 端 耐高温的dna聚合酶 选择培养基 3 pcr的每次循环可以分为三步 假设在pcr反应中 只有一个dna片段作为模板 请计算在5次循环后 反应物中大约有 个这样的dna片段 4 简述pcr技术的主要应用 要求3项以上 变性 复性和延伸 32 遗传疾病的诊断 刑侦破案 古生物学 基因克隆和dna序列测定 解析 1 dna聚合酶作用时必须要有一个引物 它只能把新的核苷酸加到已经存在的核酸的3 羟基上 与dna母链结合的rna引物就提供这个羟基 2 因pcr利用了dna的热变性原理解决了打开dna双链的问题 所以用于催化dna复制过程的dna聚合酶要具有耐高温的特性 用选择培养基可将taq细菌从其他普通的微生物中分离出来 3 dna复制的两条链均作为模板 进行半保留复制 所以复制5次后得到的子代dna分子数为25 32个 4 pcr技术可以对dna分子进行扩增 所以可用于遗传疾病的诊断 刑侦破案 古生物学 基因克隆和dna序列测定等方面 变式训练2 标准的pcr过程一般分为变性 复性 延伸三大步 这三大步需要的温度依次是 a 92 50 72 b 72 50 92 c 50 92 72 d 80 50 72 解析 当温度上升到90 90 96 以上时 双链dna解聚为单链 称之为变性 当温度下降到50 40 60 左右时 两种引物通过碱基互补配对与两条单链dna结合 当温度上升到72 70 75 时 溶液中的四种脱氧核苷酸 a t c g 在taqdna聚合酶的作用下 根据碱基互补配对原则合成新的dna链 称为延伸 a 指点迷津 一 不能正确区分细胞内dna复制与pcrpcr技术是一种体外迅速扩增dna片段的技术 与细胞内dna复制的过程相比 既有相同点又有不同点 通过列表比较的方法准确掌握两者的异同 是防止解此类问题出错的重要措施 细胞内dna复制与体外dna扩增 pcr 的比较如下表 pcr过程与细胞内dna复制过程相比 主要有两点不同 它们是 pcr过程需要的引物是人工合成的单链dna或rna pcr过程不需要dna聚合酶 pcr过程中dna的解旋不依靠解旋酶 而是通过对反应温度的控制来实现的 pcr过程中 dna不需要解旋 直接以双链dna为模板进行复制a b c d c 典例3 解析 pcr过程与细胞内dna复制过程相比 主要有两点不同 1 pcr过程需要的引物是人工合成的单链dna或rna 长度通常为20 30个核苷酸 2 pcr过程中 dna解旋不依赖解旋酶 而是通过对反应温度的控制来实现的 二 pcr的常见问题pcr实验很容易出现假阴性或假阳性的结果 常见的原因及预防措施如下 1 出现假阴性 主要原因 taqdna聚合酶活力不够或其活性受到抑制 引物设计不合理导致不能复制 提取的模板质量或数量不过关以及pcr系统的设计欠妥当 循环次数不够等等 补救措施 在原来扩增的产物中再加入taqdna聚合酶 并增加5 10次循环 预防措施 选用活力高 质量好的taqdna聚合酶 在提取dna模板时 要特别注意避免提取物中含有抑制酶活性的污染物 如酚 氯仿等 不允许有机试剂的污染 pcr扩增的先决条件以及特异性的高低 很大程度上取决于引物与靶dna的互补情况 尤其要保证引物3 端与靶基因互补 2 出现假阳性 主要原因 pcr技术高度灵敏 极其微量的靶基因污染都会造成非目标dna片段的大量增加 因此 模板dna的污染是pcr出现假阳性的主要原因 此外 样品中存在的靶基因的同源序列也可能造成假阳性结果 预防措施 隔离操作区 分装试剂 简化操作程序 使用一次性枪头等 pcr反应的最大特点是具有较强的扩增能力和极高的灵敏性 但令人头痛的问题是易污染 极其微量的污染即可造成假阳性的产生 防止污染的办法不包括 a 将样品的处理 配制pcr反应液 pcr循环扩增及pcr产物的鉴定等步骤分区或分室进行b 吸样枪吸样要慢 吸样时尽量一次性完成 枪头小套 小离心管应一次性使用 以免交叉污染c 所有的pcr试剂都应用大瓶分装 以减少重复加样次数 避免污染d pcr试剂 pcr反应液应与样品及pcr产物分开保存 不应放于同一冰箱 解析 pcr所使用的缓冲液和酶等应分装成小份 并在 20 储存 使用时 将所需试剂从冰箱拿出 放在冰块上缓慢融化 c 典例4 核心素养 请回答基因工程方面的有关问题 1 利用pcr技术扩增目的基因 其原理与细胞内dna复制类似 如图所示 图中引物为单链dna片段 它是子链合成延伸的基础 案例 15 16 三 2 设计引物是pcr技术关键步骤之一 某同学设计的两组引物 只标注了部分碱基序列 都不合理 如下图所示 请分别说明理由 第1组 第2组 引物 和引物 局部发生碱基互补配对而失效引物 自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效 3 pcr反应体系中含有热稳定dna聚合酶 下图所示表达式不能正确反映dna聚合酶的功能 这是因为 思维过程 1 思考pcr技术扩增的特点并进行计算 可以在草稿纸上画复制简图 2 观察两组引物的特点 找出设计不合理的方面 3 思考dna聚合酶的功能 dna聚合酶只能将单个脱氧核苷酸连续结合到双链dna片段的引物链上 解析 1 根据pcr过程特点绘制pcr过程示意图所示 由图可知 以原来的每条母链为模板合成的两个新dna分子中 只含有引物a或引物b 而以新合成的子链为模板合成新dna分子时 两种引物都含有 故第四轮循环共产生16个dna分子 其中含有引物a的dna分子是15个 占15 16 由图示知 第一 二轮循环合成的子链长度均不同 根据半保留复制特点 前两轮循环产生的4个dna分子的两条链均不等长 第三轮循环产生的dna分子中存在两条核苷酸链等长的dna片段 2 引物是单链dna时才能与dna结合 而单链dna的碱基互补配对部分容易形成双链结构而失去其功能 从图示可以看出 第 组引物 和引物 局部碱基互补配对 易形成双链结构而失效 第2组引物相互间不能发生碱基互补配对 但引物 自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效 3 dna聚合酶的作用是将单个脱氧核苷酸连续结合到双链dna片段的引物链上 而不能直接将两个脱氧核苷酸连在一起 方法技巧 1 若只有一条dna模板 则复制n次后有2n条dna 2 若一开始有a条模板 则复制n次后有a 2n条dna 实际操作过程中 由于无关变量的影响 一般来说实验值要略小于理论值 若扩增效率为x y代表dna片段总数 n代表循环次数 那么y 1 x n 3 dna聚合酶和dna连接酶 dna聚