【毕业学位论文】（Word原稿）光合细菌PCR检测技术的建立及其应用研究微 生 物 学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士 学位论文 光合细菌 测 技术的建立及其应用 研究 CR he of by 要 本论文以光合细菌中的沼泽红假单胞菌和类球红细菌为研究对象，根据其 16S 列和 列 设计 和筛选出适用 于 这两种菌（种水平）鉴定的 异引物 ， 优化了 应体系和程序，建立的分子生物学方法 解决 了 微生物肥料光合细菌产品检测过 程中 出现的 操作繁琐、检测周期长等问题 。 进一步应用荧光定量 术进行光合细菌含量测定研究，初步建立了定量 检测的方 法，对该技术在光合细菌菌数测定中应用做了探索性的研究。 通过分析 光合细菌 相关 基因序列的可变区，设计 了 3 对 沼泽红假单胞菌和 2 对 类球红细菌特异引物 ， 根据其对各自模式菌株的 增结果， 筛选出了 这两种菌的 异引物 。通过 对 应体系中镁离子浓度、退火温度进行优化， 建立 了 沼泽红假单胞菌 和 类球红细菌 定 方法。 使用 法 对 7 个属 18 个种共 24 株 微生物肥料中 常见光合细菌 、与光合细菌常复合使 用的菌种和杂菌 进行检测 ， 结果 目的菌株均有 清晰 目的条带出现， 非目的菌株 均 无扩增产物 。 对 增产物进行克隆测序 验证其同源性 ，其序列与靶基因序列的同源性达 100%。 使用 法 检测了 来自不同企业的 6 个光合细菌 菌剂 产品 ， 结果显示 法检测符合率为 100 ， 高于传统的检测方法 。 上述实验结果表明 ，所建立的光合细菌的沼泽红假单胞菌和类球红细菌特异 测 方法准确、 可靠、 灵敏性 强， 与传统方法相比 检测步骤 简单 ，缩短了检测时间。 通过比对紫色非硫菌科的光合细菌、微生物肥料常用菌种的 16S 列，设计 了 紫色非 硫菌科光合细菌 的 通用引物， 验结果表明该对引物在微生物肥料常用的菌种范围 内，对光合细菌具有较高的特异性。 使 用 所设计的 通用引物 ，采用荧光定量 技术 ， 建立了荧光定量 测 光合细菌的方法。 使用该方法 对 系列稀释 的 已知菌数样品 的板 进行荧光定量 增 ， 建立了荧光定量检测 标准曲线 ， 标准曲线 回归方程为： y 关系数为 检测范围在 04 07使 用荧光定量 法对 10 个光合 细菌 样品的菌数 进行了测定 ，所测菌数高于传统测定方法最大或然数法 （ ） 所测数量， 但 两 者的相关性为 P ， 表明 荧光定量 法能够反映 出不同 光合细菌 产品 数量的 差异 。 通过测定建立校正 参数 后，该 方法 将 可用于光合细菌产品 菌含量的快速 准确 测定 。 关键词 ： 微生物肥料 检测；光合细菌； 特异 时荧光定量 an to in CR by 6 CR to of to SB to in of of by of on to CR 4 8 0 4 in to be in to CR of of 00% by of CR 00%CR CR in of SB by 6SB in it SB by to SB CR NA CR of y of 07 04. SB by CR SB by of r= 定量描述微生物群落的组成 ， 在微生物生态学的许 多研究领域都是非常重要的。然而由于可培养技术的局限性 ， 定量描述微生物群落成为比较困难的事情。 术在内的分子生物学技术为人们提供了有力的工具 ， 使对微生物群落的分布、丰度等有了进一步的了解。 实时荧光定量 术作为一种核酸定量的手段 ， 以其高灵敏性、高特异性、高精确度、实时性、污染少等优点 ， 在微生物生态学中逐渐得到广泛的应用。 荧光定量 仅可以定性 ，也可以定量研究微生物群落结构组成及数量变化 ， 深入探索微生物群落与环境因子之间的相互作用及其动态变化过程。 2001） 等利用特异性 16S 物扩增两种甲苯降解菌 ，观测河流中这两种甲苯降解菌的群落动态 ， 荧光定量 果显示 ： X X. my 甲苯污染地区的丰度比非污染地区的高。 2003）中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 12 等在研究重金属污染梯度高流变区微生物群落时 ， 利用荧光定量 术量化 16S 因拷贝数和 -， -， 个系统进化类群 ，发现了与 重金属离子梯度 正相关的 类群 从而 为预测河流重金属污染的长期效应提供了进一步研究的基础 。 面 的检测 用之前 ， 定量是用传统的 迹的方法，其定量的下限是 106种方法要求的 量较大，因而其在基因表达研究应用上受到很大的限制。实时荧光定量 发明，解决了这个难题，其灵敏度可检测到 400 个分子的 以其精确、快速、污染小，已广泛应用于分子遗传学领域。实时荧光定量 法已广泛应用于 不 同生物体间、同一生荧光物体小同部位间等基因转录水平研究。 基因检测 的应用 在转基因植物中，需要考查阳性植株中外源基 因 的拷贝数， 因 为拷贝数通常会影响基因的表达和后代性状的表现。目前常用的检测技术是 交，但此技术需要大量的材料，操作繁琐，相当耗时。应用实时定量荧光 可以对基因的拷贝数作测算，即用一个己知拷贝数的内源基因作为参照，同时对样品做内源基因和外源基因的实时荧光定量 过两者达到荧光域值时的 便可得到外源基 因 的拷贝数 ； 实时荧光定量 转基 因 动物的纯合性鉴定上也有出色的表现；另外，利用定量 可以对转基 因 后 外源基 因 表达情况进行监测。 覃文（ 2003） 等用实时荧光 术定量检测转基因玉米 分；曹际娟 （ 2003）等运用实时荧光 术对转基因玉米 系进行鉴定；潘良文 （ 2003） 等运用该方法对转基因抗草甘磷油菜内源特异参照基因 外源 3 终止子进行检测。 本论文研究目的和意义 及研究内容 在微生物肥料行业中 ，光合细菌凭借其良好的使用效果，被越来越多的企业选为生产菌种。然而目前使用的 传统 光合细菌检测方法存在 着 一定的 缺点， 影响了光合细菌 菌剂 的质量检测 工作。 传统的光合细菌鉴 定基于 形态特征 和 生理 生化方法 ， 但 光合细菌生长缓慢，分离纯化工作要花费较长时间， 仅 生理生化鉴定 就 需要 4 8 天的时间 ， 因此传统方 法主要缺点是检测周期长，特异性不强 。 光合细菌菌量测定 的 标准方法是 ，而 要使 测定 结果真正达到最大几率，实验必须满足以下两个条件：一是细菌不能互相凝集，不相互排斥，而是随机分散在液体中；二是即使只接种一个细胞，也要能看见它的生长。然而在实际的操作过程中很难达到这两个要求，特别 是 后一个条件 对光 合 细菌 来说很难 达到 ， 所以 本身无法克服的一个缺点就是 计数效率 一般都比较低。 另一个缺点是检测周期长，光合细菌生长缓慢，特别是在高稀释倍数的情况下，接种的试管变红需要很长时间，最长可达 14天的培养周期。另外，培养基的选用、培养的温度和光照以及样品本身的杂菌都会对计数产生影响。 因此，迫切需要快速、准确、灵敏的先进光合细菌检测技术 和 方法 ， 以 满足 光合细菌的 质量 检测 ， 提高 质检的准确性和时效性 。 由于 法有着快速、准确和灵敏的特点，已经在医学和卫生检测方面得到了广泛的中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 13 应用，对各种病毒和病源体如乙肝病毒、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等病源菌建立了 测方法，特别是近期美国 准了禽流 感诊断方法 转录聚合酶链反应）于用于人类患者检测。这都表明了随着技术的发展，分子生物学技术将在微生物检测领域发挥着越来越重要的作用。 本研究 拟从 分子生物学 角度 ，主要 利用 法， 以微生物肥料生产中常用的光合细菌沼泽红假单胞和类球红细菌为例， 建立 快速、准确、灵敏的光合细菌 的鉴定和定量的 分子生物学方法 ，以 解决 目前光合细菌检测中 存在的问题。 本研究从分子生物学角度，主要利用 法， 以微生物肥料生产中常用的光合细菌沼泽红假单胞 菌 和类球红细菌为 研究对象 ， 建立快速、准确、灵敏的光合细菌的鉴定和定量的分 子生物学方法 ，以解决目前光合细菌检测中存在的 技术困难与 问题。 具体的研究目标是，建立 的新技术 方法使 光合细菌 的质量 检测过程简便快速 、 客观准确 和标准化 ；提高 产品 中 光合细菌菌株的纯化鉴定 的 准确 性和时效性 。同时，本论文还对实时荧光定量 定光合细菌菌数进行探索性研究 ， 为该技术在微生物肥料检测中的应用奠定基础。 为此本论文主要对以下几方面内容进行研究： （ 1） 设计 沼泽红假单胞菌 和类球红细菌种 特异引物， 优化 应条件， 建立 起 （ 2） 验证 沼泽红假单胞菌 和类球红细菌 定方法 的特异性和 扩增产物的 准 确性 ； （ 3） 定方法在产品检测中的应用； （ 4） 设计 光合细菌紫色非硫细菌的通用引物 ， 并验证该引物的通用性和特异性。并以该引物作为光合细菌特异引物， 建立荧光定量 定光合细菌菌数的方法 及其在产品测定中的应用 。 术路线 中国农业科学院硕士学位论文 第二章 实验材料和基本实验方法 14 第二章 实验材料 和 基本 实验方法 验材料 株 表 2试菌株 in 种类型 菌种名称 菌株编号 a 光合细菌 沼泽红假单胞菌 球红细菌 酸红假单胞菌 膜红细菌 R 比菌株 施氏假单胞 肠杆菌 草芽 孢 杆菌 淀粉芽孢杆菌 B. 衣芽孢杆菌 B. 短小芽孢杆菌 B. 大芽孢杆菌 ， 苏云金芽孢杆菌 B. 046 胶 胨样 芽 孢 杆菌 B. 519 T 侧孢 短 芽 孢 杆菌 氮类芽孢杆菌 多粘类芽孢杆菌 P 短短芽孢杆菌 大豆根瘤菌 10 中国农业微生物菌种保藏管理中心 ； 中国典型培养物保藏中心 ； 中国普通微生物菌种保藏管理中心 ； 湖南植保所 ； 其他为微生物肥料和食用菌菌种质检中心收集保藏 。 T 为模式菌株 中国农业科学院硕士学位论文 第二章 实验材料和基本实验方法 15 要 实验仪器 ： ： 200； 荧光定量 ： 美国应用生物系统公司 外可见分光光度计 ：北京普析通用有限责任公司 压灭菌锅 ：三洋 3020 水浴锅 ： 北京德天佑科技发展有限公司 8A 凝胶成像系统 ： Q 离心机 ： 上海安亭科学仪器厂 16B 高速冷冻离心机 ： 纯水器 ： 上海同泰科技发展有限公司 10A 超净工作台 ： 上海成顺仪器仪表有限公司 900 养基 合细菌 培养用培养基 1.0 g， 0.5 g， 1.0 g， 0.1 g， 1.0 g， 醋酸钠 1.0 g， 琥珀酸钠 1.0 g， 酵母 膏 0.5 g， 3.0 g， 蛋白胨 0.5 g， 微量元素液 1.0 维生素液 1.0 蒸馏水 1 000 量元素液成份： 1.8 g， g， g， g， 0.7 g， 0.1 g， 0.5 g， 中国农业科学院硕士学位论文 第二章 实验材料和基本实验方法 16 g， g， 蒸馏水 1 000 生素液成份： 生物素 0.1 g， 烟酸 g， 烟酸硫铵素 0.3 g， 对氨基苯甲酸 0.2 g， 泛酸钙 0.1 g， 维生素 g， 盐酸吡哆铵 0.1 g， 蒸馏水 1 000 培养基： 酵母膏 2.0 g 乙酸钠 3.0 g 1.0 g 1.0 g 0.2 g 0.5 g 5.0 g 抗氧化剂 g 蒸馏水 1 000 mL 理生化培 养基 （ 1） 碳源利用基础培养基： ( 2.0 g 0.2 g 2O 0.5 g 1.0 g 0.5 g 蒸馏水 1 000 物终浓度糖醇类为 1，其他为 ，底物过滤灭菌。 （ 2） 柠檬酸盐利用培养基 ： 5 g 0.2 g 中国农业科学院硕士学位论文 第二章 实验材料和基本实验方法 17 (2 1.0 g 1.0 g 柠檬酸钠 2.0 g 溴百里酚蓝 1%水溶液 10 脂 20 g 蒸馏水 1 000 mL 3） 酒石酸盐利用 培养基： 蛋白胨 10 g 5 g 溴百里酚蓝 （ 12.5 石酸钾 10 g 蒸馏水 1 000 mL 试剂 冲液 (1) 冲液 10 1 (2) 冲液 1010Cl( 1 (3) 1L) 至 (4) 上样缓冲液 (6) 酚兰， 20%蔗糖 (5) 电泳缓冲液 (5， 1 L) 酸 20 (6) 存液 (100 00应 所需试剂 5U/L） 、 100不含 ）、 25 自 取试剂 （ 1） 冲液： 中国农业科学院硕士学位论文 第二章 实验材料和基本实验方法 18 分别 称取 硫氰酸胍（ 和 式环已二胺四乙酸（ 2- N， N， N， 称 溶解于 20度为 40 冲液中 ， 待试剂完全溶解后，用相同浓度的 液定容至 50成浓度 4 的 冲液 。 （ 2） 洗涤缓冲液： 按下列组成成分配制 500涤缓冲液：无水乙醇 60， 20， 00，用超纯水定容至 500藏于玻璃瓶中。 （ 3） 硅藻土吸附缓冲液：称取 5g 硅藻土（ 司出品，商品名为 用 1 次，最后按 1： 1（ w/v ）加入 1冲液，配成硅藻土吸附液。 （ 4） 8g 2O 1 000mL 5) 2% 2 mL 100 隆测序试剂 自天根生物公司； 50mg/经科生物公司； 载体 购自 宝生物工程（大连）有限公司 感受态细胞 大肠杆菌 自鼎国生物公司； 引物 ： 5 3）： （ 5 3）： 引物 由上海生工合成 剂 剂盒购自宝生物工程 (大 连 )有限公司 ； 联管 购自 司 。 本 实验方法 ： 合细菌的培养 用培养基 光合细菌进行活化，光合细菌的富集使用培养基 养条件中国农业科学院硕士学位论文 第二章 实验材料和基本实验方法 19 为：温度 30 34 ，光照为 1000 2000 合细菌 总 取 A. 菌体收集： 取 液于 中， 9000r/心 4集菌体， 20保存。 B. 将收集到的菌体用 1冲液洗涤菌体 2 次。 C. 加入 500L 冲液，混合均匀 ， 静置 20 D. 将硅藻土吸附缓冲液充分摇匀，每管加入 20L30L 该吸附液， 振荡均匀后室温放置 15 E. 13000r/心 30s，弃上清，再加入 20冲液，混合均匀后室温放置 10上法离心处理。 F. 洗涤缓冲液洗涤上述硅藻土沉淀 3 次，每次 300L。 G. 用 200L 70的酒精洗涤硅藻土沉淀 1 次， 13000r/心 2去酒精溶液，真空抽干。 H. 最后根据每管加入硅藻土的量，向每管加入 20L 30L 1冲液，在涡旋振荡器上充分混合均匀， 65 保温 30 I. 13000r/心 5心将上清液移至另一支已编号的 ，该溶液即为从菌株中提取的 品。 品贮藏于 。 合细菌基因组 电泳检测 1%凝胶 ， 色 30140V 稳压电泳 50通过 凝胶图像分析仪下分析结果。 合细菌基因组 浓度和纯度测定 提取的光合细菌 紫外分光光度计检测其浓度。 量测定方法：将提取的 板进行适度稀释，用紫外分光光度计测定 260D 值 。 量 =释倍数 50 g000 中国农业科学院硕士学位论文 第三章 光合细菌 定技术的 建立及其应用研究 20 第三章 光合细菌 定技术的 建立及其应用研究 本章利 用细菌遗传物质中高度保守的核酸序列 （ 16 ，对微生物肥料中常用 的 光合细菌 沼泽红假单胞菌（ 类球红细菌（ 进行 特异引物设计， 使用 已知 模式 菌株进行 证 ，以 筛选特异性引物 ；并优化镁离子浓度和 确定 退火温度 等环节， 建立这两种光合细菌的 定 方法 ，同时 对 其 扩增产物克隆测序 ，检验其 是否为目的产物 。 通过 对不同属种光合细菌、光合细菌复合使用的菌株和杂菌进行 增，验证 建立的 定方法的特异性。 并 使用 定 方法 检测光合细菌产品， 考察 该 技术在产品检测中应用的 可行性 。 验方法 物设计 与 初筛 首先 在 据库中检索并下载 红假单胞菌属和红细菌属 各个菌种 的基因 序列 ， 在此基础上筛选出可以进行种间比对和引物设计的靶基因 16 因序列，通过件对各个种的基因进行差异水平分析 ， 选 择 有差异的片段设计种特异引物。 设计引物时 遵循 以下原则：（ 1）引物长度为 18 24 个碱基；（ 2） 在 55 65 ，引物 间的 ， 量在 40% 60%；（ 3）避免引物自身形成发卡结构； （ 4）优先考虑变异发生在 3端、变异碱基 3 个 以 上 的 引 物 。 将 设计好的 引 物 在 互 联 网 上（ ）进行比对，每条引物在本种内的同源性应为 100，与其他种群的菌株同源性则应很低。 使用 设计好的特异引物， 采用表 3的反应条件，对 各自模式菌株基因组 行 根据 果筛选特异引物。 表 3应条件 CR 增反应体系 (20l)： 环条件 10 2 L 10） L 引物 R（ 10） L 引物 F（ 10） L （ l） L 模板 1L 补足 20 L 初始变性 95 5 性 95 40s 退火 理论退火温度 40 s 30 个循环 延伸 72 30 s 最后延伸 72 10 应条件 的 建立 使用筛选出的两个特异引物， 分别 以各自 模式菌株沼泽红假单胞菌 因组 模板 （ 模板 取方法见 ， 在不同退火温度和镁离子浓度的中国农业科学院硕士学位论文 第三章 光合细菌 定技术的 建立及其应用研究 21 条件下进行 增，根据 应结果确定 应体系和反应条件。 火温度确定：设计梯 度 应程序，退火温度依次为 55 、 、 、 、65 ， 根据结果选择能够出现目的条带的最高 退火温度 为方法的退火温度 。 离子浓度确定：反应体系中镁离子体积分别为 根据结果选择能够出现目的条带的最低镁离子体积为方法的镁离子浓度。 已 确定的退火温度和镁离子浓度的条件下 ，对 种内各个 菌 株进行 增，检查在此反应条件下种特异引 物在种内的通用性。如果 有菌株 应为阴性 ，对反应条件进行 调整 ， 直到各个菌株都出现目的条带为止 ，以此反应条件作为种特异 反应条件。 定方法 特异性 验证 以表 2供试菌株基因组 模板 （ 模板 取方法见 分别使用沼泽红假单胞 菌 和类球红细菌的特异引物 ，在已建立的 应条件下 进行 扩增， 检 验 引物 的种特异性 。 物序列测定 物的回收 （ 1）检测合格后将所有的产物于大点样孔点样、电泳。 （ 2） 电泳后在长波紫外光下，迅速用干 净的手术刀割下含所要回收的琼脂块，放入 （ 3）加入 100加 400L），混匀后置于 50水浴中 10 2 匀一次），使胶彻底融化。 （ 4）将融化的胶全部转移到 中，柱子放入 温放置28000r/心 1 （ 5） 取下 ，弃去离心管中的废液，将柱子放回同一离心管中，加入 50010000r/心 30s。 （ 6）重复步骤（ 5）一次。 （ 7） 取下 ，弃去离心管中的全部废液，将柱子放回同一离心管中， 10000r/0s，以除去残余的 （ 8）将柱子放入干净的 心管中，在柱子中央加入 20100L 温放置 2高洗脱液的温度至 55有利于提高 洗脱效率。 （ 9） 10000r/心 1 集离心管中的液体即为回收的 段。 增回收产物与 T 载体的连接 按照上海生工的 T 载体 物克隆试剂盒说明来操作：在 增反应管中，依次加入下列各成分， 16 连接过夜。 国农业科学院硕士学位论文 第三章 光合细菌 定技术的 建立及其应用研究 22 纯化后的 物 L L L 组质粒的转化和蓝白斑筛选 （ 1）将感受态细胞从超低温冰箱中拿出，置于冰上解冻，取 50L 加入 心管中，将连接液全 量（ 入该离心管中，轻轻混匀，冰浴 30 （ 2） 热击 90s，立即置于冰上 2 （ 3）加入 450 l 体培养基，于 37 ， 200荡培养 60 （ 4）在一制备好的含氨苄青霉素 100g/L 的 板上加 40l 存液（ 20mg/ 16L 50mg/涂布均匀， 37 放置 60 （ 5）取（ 3）中的 100l 涂布于（ 4）中平板， 37 培养 12成单菌落，再将平板4 放置数小时，使蓝色充分显现。 重组克隆在 板上呈现白色，而非重组克隆呈蓝色。 性克隆的检测 （ 1）挑选白色菌落若干，用无菌牙签点种于新鲜 脂平板上（ 2 点 /菌落）， 37 培养 12 2）用无菌牙签取菌落于 20l 超纯水中，沸水煮 15 3） 12000心 3-5 清作为 应模板。 （ 4）在 中加入下列各成分 增反应体系如下 (20l) : 10 2 L 10） L 引物 10） 1 L 引物 10） 1 L （ l） L 模板 2L 补足 20 L 环条件 初始变性 94 4 性 96 30 s 退火 50 15 s 26 个循环 延伸 60 4 最后延伸 72 10 5） 1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物片段大小。 中国农业科学院硕士学位论文 第三章 光合细菌 定技术的 建立及其应用研究 23 列测定及 比对 将转化成功的备份菌落接种至 体培养基中， 37 培养 12培养液交由上海生物工程有限公司测序 。测序结果 用在互联网上（ ）进行比对。 敏度检测： 取起始浓度 为 1g/L 的基因组 灭好菌的 其逐步 按 1： 10； 1： 100； 1：1000； 1： 10000； 1： 100000； 1： 1000000 稀释， 分别取 1应，来确定 应的灵敏度。 法在光合细菌产品检测中的应用 选取 6 个光合细菌 菌剂产品 ，分别使用传统 鉴定 方法和 法进行检测， 比较两种方法的结果， 考察 该 技术在产品检测中应用的 可行性 。 统 鉴定 方法 1. 光合细菌的分离 纯化 将样品在 R 培养基琼脂（ 板上划线，在厌氧条件下， 28 30 光照培养 47 天。挑出典型菌落，重新划线培养，直到 菌落一致 为止。 2. 光合细菌生理生化的鉴定 对已纯化好的光合细菌做 以 下几 项 生理生化实验 ： 柠檬酸盐、硫代硫酸钠、乙醇、甘露醇和酒石酸盐利用实验 （参照东秀珠常见细菌系统鉴定手册） 。 法 1. 样品 取 按 法提取 。 2. 法的应用 采用 的 反应条件和反应体系 进行。 3. 产物测序 物直接测序，测序由上海生工完成。 果 与分析 物设计 与筛选 设计的引物及其序列见表 3用这 5 对引物分别对各自的模式菌株进行 增，扩增产物通过 1琼脂糖凝胶电泳检测，根据实验结果筛选出能够特异扩增的合适引物。 使 用表 3的 5 对引物分别对各自的模式菌株沼泽红假单胞菌 类球红假单胞菌 行 增，实验结果 见 图 3图 3见，