【毕业学位论文】（Word原稿）水稻矮秆DWARF1-Like基因的精细定位生化与分子生物学论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 水稻矮秆 因的精细定位 F N F N y u A 要 植物中矮秆突变体不仅对于阐明植株生长与发育机制非常重要，对作物，特别是水稻，小麦等主要农作物，育种改良也很有帮助。目前水稻中已报道有六十多个矮秆突变体，但真正分离到引起矮秆突变的基因并阐释其突变的本质还是不多，调控植株高度发育的网络机制远未建成。因此发现新的矮秆突变体并理解其突变机制很重要。我们从籼稻品 种 9311 中发现一自发突变的矮秆水稻，该突变体与矮秆突变体 似：茎短而壮；叶片颜色深绿、宽而短，但叶片卷曲或扭曲，粒型变小， 将这个基因暂命名为 遗传分析和等位性测验表明该突变体的表型受隐性单基因控制，且不与 d1,d2,位。激素处理的结果显示， 矮杆性状表现为 敏感型。 为了研究 因的功能，我们从大约 6,500 株 500 个突变个体用作定位群体，用图位克隆的方法精细定位了基因。首先将基因定位在水稻第 9 染色体 短臂上，最后将 点定位在约160基因组 域。基因的分子定位为以后的基因克隆及功能分析打下了良好的基础。 - 关键词 ：水稻， 变体 ， 因，精细定位 in is in as 0 in a of in of is so is . A in a 311 . of We as of by to d1,d2,is to A, it is A To we - by a ,500 us to a it in a 160kb an to be by .), 录 摘 要 . I . 一章 文献综述 . 1 1. 水稻矮秆性状的遗传研究 . 1 2水稻植株矮化机制研究 . 1 稻植株矮化与节间或细胞长度、数目的关系 . 1 稻植株矮化与温度的关系 . 2 3 关的株高突变体的研究进展 . 2 A 反应的正向调节物 . 3 A 反应的负向调节物 . 5 4. 矮化植株与 系的研究 . 5 5. 水稻基因精细定位与克隆 . 6 位克隆的原理 . 6 图位克隆的应用 . 7 物信息学的应用 . 7 变体资源的应用 . 7 - 6本论文研究内容提出 . 8 第二章 材料与方法 . 9 1 实验材料 . 9 1 1 植物材料 . 9 1 2 常用分子生物学试剂 . 9 2 实验方法 . 9 2 4 突变体的生理学分析 . 10 2 5 定位群体 . 10 2 6 水稻 取 . 10 2 7 通过 记定位 因 . 11 2 8 因的物理定位 . 11 第三章： 结果与分析 . 12 1. 水稻矮秆突变体 分离及遗传分析 . 12 1 稻矮秆突变体 分离 . 12 稻矮秆突变体 遗传分析 . 13 2. 水稻矮秆突变体 d1,d2,两个新发现 等位性实验 13 3. 生理学分析 . 14 4. 因的图位克隆（ . 15 因的初步定位 . 15 因的精细定位 . 17 . 18 第四章 结论与讨论 . 19 参考文献 . 20 致 谢 . 27 作者简历 . 28 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 - 1 - 一章 文献综述 1. 水稻矮秆性状的遗传研究 从广义上讲，水稻的矮生性是指成熟期水稻株高比正常植株缩短的遗传特性。同时，根据株高缩短的程度，又可将广义的矮秆分成半矮秆、矮秆和极矮秆 3 种类型。矮秆（狭义）通常指成熟时植株高度等于或低于原正常植株高度 一半的矮秆突变系；半矮秆则是指株高介于矮秆和正常高度之间的类型。 经典遗传学表明水稻株高既属于数量性状，又表现为质量性状遗传。在籼稻中，矮秆遗传主要受 1 个隐性半矮秆基因控制（ 遗传力较高，与高秆品种杂交后代呈高秆和矮秆的双峰分布，并且大多数半矮秆籼稻品种的半矮秆基因均为 复等位基因。在粳稻中，矮秆遗传与籼稻相似，但根据控制矮秆的基因对数可以将粳稻矮秆品种分为两类，一类由单个矮秆主效基因控制；另一类由多个矮秆微效基因控制，而且，控制粳稻矮秆的主效基因一般为非等位关系（顾铭洪等， 1980）。 20 世纪末，随着分子生物学的发展，利用分子标记对控制水稻株高性状进行 测，将对水稻矮秆性状遗传研究从经典遗传学的水平深入到分子水平，为最终阐明水稻矮秆的遗传机制奠定了基础（吴平 , 1996）。 1986 年日本的水稻基因符号、命名和连锁群委员会（ 矮秆基因统一定名。具有强矮化效应、植株表现为矮秆（狭义）类型的基因定名为 d 系统，而具有较弱矮化效应、植株表现为半矮秆类型的基因 定名为 统，根据被鉴定的时间顺序，从 1 往后排（ 1986）。目前，已分别注册到 中部分矮秆（半矮秆）基因是相同的或等位的；例如， 16 ， 别是等位的（ , 2001）。 2水稻植株矮化机制研究 水稻植株矮化是矮秆主基因表达作用的结果，同时也受到修饰基因或抑制基因的影响（ , 1997）。一般认为矮秆基因的作 用能直接导致水稻植株形态学或细胞学的变化，如节间变短和细胞个数减少，从而使植株变矮；同时，基因的表达还受到外部环境和内源条件的影响。 稻植株矮化与节间或细胞长度、数目的关系 一般认为，水稻植株的矮化是由于节间长度缩短或节间数减少的结果，也可能是两者共同作用的结果。 （ 1969）以节间长度占株高的比例为指数，将矮秆分为 种基本类型，而将节间比例正常的品种标定为 N 型。 的特征是节间比例与 N 型相同； 的特征是倒 2 节间特别短； 的特征是倒二节间 缩短； 的特征是有颈叶，倒 1 节间短而第 4 节间长，偶尔有第 6 伸长节间； 的特征是倒 1 节几乎不伸长，穗子包藏中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 - 2 - 在剑叶叶鞘中。除 以外的所有矮秆类型都存在某一节间显著缩短的特征。这表明不同的矮秆基因作用于水稻植株的不同伸长节间，换言之，矮秆基因对植株的矮化作用只是在某一特定生长时期发生，结果导致某些节间显著缩短。 20 世纪 80 年代前，有关水稻矮秆机理的研究主要集中在外部形态。由于细胞的生长和功能决定植株器官的结构和功能，分析水稻植株的矮化机理有必要进行细胞学的研究。 （ 1981）通过对许 多等基因矮秆系的研究，发现节间长度与细胞数目呈高度正相关，而与细胞长度无显著相关性，表明节间的缩短可能是细胞数目减少的结果。 稻植株矮化与温度的关系 部分矮秆基因对水稻植株的矮秆作用与温度存在相互作用。矮秆突变系“ 原品种“ 不同温度下的节间长度差异存在明显变异：在 25高温条件下，株高只有 46为原品种的 56%；在 18低温条件下，其株高达到 60是原品种的 84%。对细胞组织形态进行观察发现，在高温条件下生长的 间薄壁细胞排列不规则，纵向细胞数减少，但横向细胞数明显增加。而在低温条件下细胞生长则无异常现象发生。这表明 矮秆基因对温度敏感，在高温条件下由于居间分生组织的异常使植株矮缩。此外，携带矮秆基因 植株在低温条件下生长时表现矮秆小粒，在高温条件下则表现正常（ , 1981）。 3 相关的株高突变体的研究进展 过去的近五十年，世界人口迅猛增长，从 30 亿增加到 60 亿，粮食危机日益严重。由于半矮秆基因 (入水稻而促进世界范围内水稻 产量的大幅度提高，对于解决日益增加的粮食危机具有重要的作用。这项矮化育种的成就举世瞩目，被誉为绿色革命 (2002; 2002; 003)。茎是支撑植物直立生长，及稳定性的重要单位。合适的株高是对于决定植株的生长，特别是对于禾本科作物的结实具有重要的作用。因此，研究植株生长机理，对合理有效地利用这些资源，改良品种无疑具有重要作用。 在所有已知的株高突变体中，它们绝大多数都与激素有关，特别是与 成有关。目前，虽然在植物体内还没有分离到 受体，但是通过分离 号的上游调控物质，或者顺式及反式的下游调控因子，有关 植物体内的合成及功能研究取得了较大进展。通过有关激素生理学研究，确定各合成突变体的阻断位点，基本弄清了 物合成的主要途 径（图 3） (998; 2002; 2002)。在玉米中，已鉴定出至少 5 个参与 成的基因 些基因变异后最显著的影响是导致植株矮化及雌穗雄化。此外，这些变异株中的 量比正常对照的要低得多。施加外源 变异株的高度及其他性状恢复正常。 通过进一步的研究已经找到了这些突变基因的阻断位点。在拟南芥中也鉴定了 5 个参与 成的基因 ( 在豌豆中也发现了类似的变异 ( 目前关于 能的基本一致的看法是： 1 促进茎和叶伸长。 2 诱导种子中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 - 3 - 发芽。 3 调节开花时间和花、果实及种子的发育。下面就调控 号的相关突变体的研究作一综述。 图 1A 的合成 A A 反应的正向调节物 变体 稻矮杆突变体 (1999; 2000)和 敏感突变体 (2003; 004)以及拟南芥突变体 (1998)均表现为半矮杆（约 90 110叶色深绿。 码 G 蛋白的亚基，它的突变导致植物体内的 量明显降低，但是高于其它 成途径缺失的突变体。当外施 ，它的矮杆表型不能完全被恢复，即使在饱和浓度的 理时，也只能部分恢复表型。在橡胶糊粉层研究中证明， G 蛋白做为信号分子发挥了重要的作用。在突变体 ，因 G 蛋白并不参与 成，所以推测其与橡胶中一样，参与 号传导。然而，一个值得探讨的问题就是：拟南芥中也只有一个 G 蛋白，但是，当用外源 理时，拟南芥 G 蛋白缺失突变体 够恢复表型。这说明在不同的植物体内， G 蛋白的功能并不完全一致。在水稻中还存在另一种 号途径 (004)。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 - 4 - 周期反应 1 突变体（ 光周期反应 1 突变体（ (2001)是在短日条件下筛选那些表达量有所变化的基因时发现的。当将 因反义抑制时，发现植株株高变矮，并且对外源 敏感。 过量表达 ，植株表现出生长更快，比野生型对 敏感。证明 一个 号的正向调节物。将 白与 白融合，发现 核中表达，证明 位在核中。在果蝇和无脊椎动物中，信号分子 两种重要组份犰狳 ( 们中包含一种保守结构域，命名为犰狳。 括 7次犰狳 (复。 列的缺失证明这段序列在核定位过程起作用。 变体 码一种 白，可能是 一类 3 连接酶 合体的一个亚基。合体除了包含 白以外，还包括 白以及含 构域的 白 (1998; 1999)。其中 白结合到 过程中， 白的 N 端的 40 60 个氨基酸是必需元件，而 C 端则在识别哪些蛋白可以与 3 复合体相结合以及在 26S 蛋白酶降解的过程中起作用。已经证明由 导的蛋白水解在植物体的多种发育过程，比如花发育、光周期反应、光受体信号、衰老以及激素信号中均有调控作用。 A 信号过程中的负调控物 稳定性来达到控制 应，进而控制植物高度。 变体 变体 现为明显的矮化，并且对 现不敏感。 白包含 除了控制株高以外，还与 起相互作用去调控开花时间。在短日照条件下， 双突变体表现出了开花时间严重延迟。它们共同参与 号的调控。 此外， 参与 号以外的生理反应。当 双突变体中，出现了异位叶的表型。因此，虽然 与 号是肯定的，但是，如何 号中发挥作用以及如何调控异位叶的出现，仍不清楚。 A 不敏感突变体 1（ 白与酯酶、脂肪酶和蛋白酶等苏氨酸家族成员极其相似，但是它在体内的功能仍然不清楚。当用 理突变体时，淀粉酶活力并不像已知的与 关的突变体，如 是 表达量却高于野生型。另外，通过与 建双突变体，发现突变体表现 表型，证明它是在 上游参与 号。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 - 5 - A 反应的负向调节物 白 有自己独特的 构域。 蛋白已经从多种植物体，如拟南芥 (1997; 2001; 2002)、小麦 (2002; 2002)、水稻 (2001; 2001)和大麦 (999)中鉴别获得。这些突变体可以分为两类，一类是半显性的拟南芥、小麦和大麦矮杆突变体。另一类隐性的是株高伸长的拟南芥、大麦和水稻突变体。大麦和水稻中的两个这样的基因是 它们在体内作为 径的负调控因子参与植物的生长发育过程。 突变导致 变体中的一些如毛状体起始延迟、茎杆变短等表型消失。 是没有 显。 双突变的植株株高及开花均恢复正常，甚至 含量还有所提高。 三突变体不能够发芽 ,说 明它们还在控制发芽过程中起作用。 变体含有比野生型更多的 性物质，反馈调节 合成。 白在 缺失 17 个氨基酸，因而导致蛋白失活而不能降解 量提高，进而表现出茎节伸长的表型。 变体 c/ 1999)。该突变体表现为下胚轴较短、偏上位的子叶节、叶基部较窄和短叶柄，这种表型在第一叶表现的尤为明显。虽然突变体 外施 能恢复 此， 据转座子的插入位点及 实 野生型的 示 少 1999; 2001)。 少了淀粉酶的表达，说明 而，因为拟南芥中有九个 以 此，有关 需进一步的研究。 4. 矮化植株与 系的研究 近年来的研究表明水稻矮化也与 合成及其信号传导受阻有关。在拟南芥中已经克隆到 13 个与 成相关的基因（ 及 4 个与 导相关的基因 国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 - 6 - 中 别编码一个富含亮氨酸的蛋白激酶， 码一个丝氨羧肽酶， 对 号转导的负调控，它位于 游，编码一个 似的激酶（ , 2001； , 2002;， 2004， 2004）。在水稻中也克隆到了 3个与 成相关的基因 及 1 个与 导相关的基因 2000; , 2002; , 2003;， 2005）。 5. 水稻基因精细定位与克隆 随着拟南芥和水稻基因组的测序完成，一个重要的目标就是鉴定和克隆在农艺生产上有价值的基因。目前主要的策略是采用图位克隆法以及利用突变体和生物信息学。 位克隆的原理 克隆基因最经典的方法就是图位克隆法（ 它是基于遗传作图和物理作图的一 种克隆基因的方法。它的原理是根据功能基因在基因组中都有稳定的基因座位，在利用分子标记技术对目的基因进行精细定位的基础上，用与目的基因紧密连锁的分子标记筛选基因组文库，从而构建目的基因区域的物理图谱，再利用此物理图谱通过染色体步行（ 逐步逼近目的基因或利用染色体登陆（ 方法最终找到包含目的基因的克隆，并通过遗传转化试验来验证目的基因的功能。 图位克隆法无需预先知道基因的 列和其表达产物的有关信息，但是应具备两个基本条件：一是构建 遗传群体。常用的遗传群体有 交（ 加倍单倍体（ H）、重组自交系（ 近等基因系（ 以及由这些群体衍生的群体，如测交群体（ 高代回交群体（ 二是具有包含目的基因的遗传图谱和物理图谱。构建遗传图谱 常用 的 分子标记有：限制性片段长度多态性 ( 微卫星 (、序列标记位点 (和酶切扩增多态序列 ( 图位克隆法主要包括四个基本技术环节：目的基因的初步定位；精细定位；目的基因所在区域物理图谱的构建；筛选 库或基因组文库并进行功能互补实验。其中目的基因的精细定位是图位克隆策略中最艰苦和最耗时的限速步骤。利用 混合样品作图可以有效地提高精细定位的效率（ 1993）。混合样品作图是在准确鉴定目的基因的表型的基础上，把大群体中的单株分别混合提取 用目的基因附近的所有分子标记对混合的 品池进行分析，根据所有池中包含有交换的 的比例来确定与目的基因最连锁的分子标记和目的基因附近分子标记的顺序。混合样品作图技术可以极大的提高分子标记分析效率，减少 取的工作量，有利于扩大群体，加快基因克隆速率。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 - 7 - 图位克隆的应用 随着水稻高精密遗传图谱和物理图谱的相继构建成功（ ， 1998； ， 2002），尤其是 全基因组测序结果的公布（ 2002； ， 2002），为水稻基因的精细定位以及后续的图位克隆创造了优越的条件。早期在水稻中克隆的两个抗白叶枯病基因和两个抗稻瘟病基因均是利用图位克隆战略完成的。其中 克隆是在获得了一个与抗病基因共分离的分子标记进行染色体登陆实现的（ ， 1995）；而 是通过染色体步行实现的（ ， 1998； ， 1999； ， 2000）。最近报道的一些水稻基因的图位克隆则是以突变体为材料，如矮秆基因 分蘖基因 矮秆基因 1999; 2003; ,2003; ,2003）。 从 13000 个 株中选取了 3185 个矮秆植株，应用 分子标记将 因定位于 小区域内，并应用 1 基因 以 起点的图位克隆则相对于主基因的克隆更为困难一些，主要是由于 效应一般都较小又受基因组背景的调节，且易受环境的影响。 1996 年 次在番茄中克隆了控制果重的 ， 1996）。迄今，最为成功的例子莫过于日本研究人员对一系列水稻抽穗基因的克隆： , 2000; , 2002; , 2001）。 应用 群体（ 9000）将 位于约 12 小区间，并最终克隆到了与拟南芥花期基因 源的 因。 物信息学的应用 随着拟南芥和水稻基因组的测序完成以及数据的释放，生物信息学越来越突现出其重要性。当目的基因精细定位到一定小的区域时，候选基因的确定就非常关键 了。应用生物信息学可以快速、省时和准确地确定目的基因。 将单分蘖基因 细定位到约 20 小区间，通过基因注释，发现在 20 小区间里有一个编码蛋白与番茄的 S)蛋白高度同源。而在番茄中， 因缺失功能的突变体则表现出不能分枝的表型。从而以此作为候选基因，通过 构和互补实验等最终克隆 因。 对 克隆同样依赖于生物信息学。在 细定位甚至是初步定位的基础上，利用生物信息学提取众多的预测基因，并通过对性状及生理生化等的分析，从而可 以确定候选基因，最终克隆基因。最近， （ 2004）就利用日本晴及其一个近等基因系 于第 1 染色体长臂上的一个淀粉合成相关基因：蔗糖磷酸合酶（ 变体资源的应用 近年来，利用突变体资源克隆基因发展迅速。相对于图位克隆法需要花很长的时间来缩小基因或 处的区域，利用突变体克隆基因具有快速，便捷的优势。 目前建立突变体库的方法主要有以下几种方法： 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 - 8 - （ 1） 接插入法。 用其转移特性插入到植物基因组中。 在基因组不同的部位造成各种插入结果。由于多数突变性状是由隐性基因决定的，所以一旦确定了突变性状和 连锁的，就可以通过获得 旁邻序列，从而 得到被标签的功能基因。 （ 2）转座子系统插入法。由于转座子的特殊特性（它的插入会引起基因突变，而当它割离之后基因的功能又可以恢复），可以将它作为一个插入突变原，用来克隆因为转座子插入而失活的基因。 （ 3）逆转座子标签法。逆转座子被认为和基因的复制和基因的表达调控相关。当植物染病、创伤或是在组织培 养时都会发生逆转座子的转座。 （ 4）增强标签法。因为正常情况下基因产物的数量是限定的，必须与其他产物达到平衡。基因产物的不足和过量都会破坏这种平衡，并表现出生长与发育的异常。该标签系统在 使细胞中某一基因过量表达。 根据突变体的表型，利用生物信息学可以查找拟南芥以及其它禾本科作物中已经克隆到的基因，通过序列的比对，在水稻中找到一些同源基因，继而进行基因的克隆与功能研究。最新报道的一些水稻基因就是通过这种策略完成的，如 ,2001; ,2000; , 2002 )。 获得一个单隐性矮秆突变体后，通过表型的观察、外源激素的处理以及内源激素含量的测定，发现矮秆是由于 成的一个关键酶 过数据库的查找，发现了一个与番茄中编码 因以及拟南芥 因同源的 生型和 列的测定验证了缺失和插入引起了移码并造成了的 功能缺失。 6本论文研究内容提出 植株株高是构成植株株型的重要因子。适宜的株 高是保证农作物高产的重要保证。六七十年代在小麦、水稻的矮化育种而掀起的“绿色革命”即是明证。水稻中已报道有六十多个矮秆突变体，但分离出的矮秆突变的基因并阐明其突变本质的还不多。由于植株生长发育是一个很复杂的现象，有很多基因参与调控。因此利用更多的矮秆突变体，分离出更多导致矮秆突变的基因，不仅有利于弄清植株形态建成的内在分子机理，而且有助于建立主要农作物分子辅助育种体系。 本研究的水稻矮秆突变体 自籼稻 9311 自发突变后代， 该突变体与矮秆突变体 似：茎短而壮；叶片颜色 深绿、宽而短，但叶片卷曲或扭曲，粒型变小。 目前 它编码一个 G 蛋白亚基，参与了 信号传导 ， 而且 因很可能单拷贝存在水稻基因组。但 上下游关系还很不确切， 号传导的途径还很不完整。分离因有助于建立基因之间互作关系。 我们拟采用图位克隆的方法精细定位因，为今后分离 因和研究其功能，在分子水平上阐明水稻植株高度