【毕业学位论文】（Word原稿）阴离子盐和维生素D对围产期奶牛钙调控机制和健康作用的研究动物营养与饲料科学博士论文

密 级 : 论文 编号 : 中国农业科学院 博士学位论文 阴离子盐和维生素 D 对围产期奶牛钙调控 机制和健康作用的研究 f F I 摘 要 本论文通过六个试验系统地研究了在奶牛 产前 日粮中添加阴离子盐 和维生素 D 对奶牛 体内酸碱平衡、离子代谢状 态、与钙代谢密切相关的激素和酶、免疫功能 的影响。并通过人工瘤胃和安装瘤胃 瘘管 的奶 牛初步探讨了不同浓度的阴离子盐对瘤胃发酵功能的影响。 试验 一研究 了 添加阴离子盐对围产期奶牛血液酸碱平衡状态，血液离子平衡 、尿液离子排泄情况的影响。结果表明， 为 试验组能够显著改变血液的酸碱平衡状态，试验组全血中的 碱剩余 值 与对照组相比差异显著 (奶牛在饲喂阴离子盐后处于代谢性酸中毒状态时，尿液 著降低，尿液中的钙离子和氯离子排泄量显著增加 ( 试验二和三通过人工瘤胃和瘘管 奶 牛研究了不同浓度阴离子盐对瘤胃发酵的影响。结果表明，在饲喂后的 2h6h， 试验组与对照组相比，能够显著降低人工瘤胃和瘘管奶 牛瘤胃的 不同浓度的阴离子盐对瘤胃液中的纤维素酶活性没有显著影响 (P 试验四研究了 阴离子盐 和维生素 D 日粮 对围产期奶牛血清中 的离子平衡状况、与钙代谢密切相关的激素和酶的影响。结果表明，阴离子盐 组 和 阴离子盐 与 维生素 D 同时添加组 在分娩前7d 及分娩 当天 与另外两 组相比，能够显著增加血清中的氯离子含量 (产后7d 各组 达水平 下降 。围产期 T 细胞和 T 细胞数均下降，到分娩时降到最低点，然后回升，并且 T 细胞比 T 细胞下降明显 ，通过在产前奶牛日粮中 添加适量 维生素 D 和阴离子盐 可缓解此种情况，其中 含 维生素 D 日粮 的作用 效果 强于阴离子盐日粮。 试验六研究了 阴离子盐和维生素 D 日粮 对围产期奶牛血清代谢参数、 生产性能 和 健康状况的影响。结果表明含有阴离子 盐 的处理组能够显著提高血清中的 度 ( 能够减轻乳房水肿发生的严重程度，减少产后胎衣不下的发生， 在奶牛产后的第 2、 3 个泌乳月， 能 显著降低牛奶中的体细胞数 ( in to of of in on 150 pH in s to of in on a TH in T T in of to of in on UN in 0 00g) 性的 低血钙 阴性 ( 衡量血气平衡的另外两个重要指标，试验组与对照组相比 异不显著 (P对照组和试验组全血 组间的差异达到显著水平 (而离子状态的钙含量显著高于对照组 (同一组 在分娩前后的不同采血时间点 也 无显著性差异 (P试验组 在分娩前 2周及分娩当天 血清中的氯离子含量显著高于对照组 ( 试验组 奶牛在 产犊前 2周及分娩当天尿液中的氯离子排出量显著高于对照组 ( 在补料 6h 后各处理组 开始上升，在随后几个 采样 点负 的各试验组与对照组相比差异不显著 (P 表 3同 条件下 人工瘤胃 、 )的动态变化 of in 目 N mg/酸 00 酸 00 酸 00 采样时间粮 50 100 150 b 50 100 150 b b 50 100 150 a 50 100 150 a 50 100 150 0 50 100 150 合标准误 值来源 P 处理 在试验期内， 不同 人工瘤胃培 养液 的 乙酸 、 丙酸和丁酸浓度在各 组 间的 动态变化情况见表 3从表中可以看出， 各 组乙酸、丙酸含量的 变化趋势为 补料 后 均 开始上升，在 补料后 的 4h6h 达到最高点， 然 后缓慢下降。 同一 组内乙酸占总挥发性脂酸的 摩尔 百分比在补料后2h6h 内呈下降的趋势，在随后 各时间点又逐渐回升。 为 试验组 与对照组相比在 补料后 2h，乙酸占 摩尔百分比 显著 降低 ( 在试 验期内， 度的动态变化趋势见 表 3 图 3各 组 生量 共同的变化趋势是在 补料后迅速上升 ，并在 补料 后 的 4h6h 达到最高 浓度 ，而后逐渐下降， 并 维持在一个恒定 的水平。 为 理组 在 补料后的 2h、 4h 和 6h 与对照组相比差异显著 (P 乙酸 /丙酸的动态变化趋势见表 3 图 3由本试验可以看出，同一 处理 组在不同时间点乙酸 /丙酸 比值呈现一定规律性的变化 ， 即先下 降后又逐渐回升。不同处理组之间 总的趋势是为 理组 在补料后 2h、 4h 和 6h 乙酸 /丙酸 比值显著低于对照 组 ( 在 本 试 验 中 ， 人工瘤胃液内纤维素酶的活性 变化 情况 见表 3从纤维素酶 活性 的变化 趋势来看，在相同时间点添加阴离子盐的各试验组与对照组相比，纤维素酶活性没有显著变化。 通 过以上数据的分析可以看出 为 试验组对人工瘤胃的发酵会有一定程度的影响。 05101520253035400 2 4 6 8 10对照组 50100 150中国农业科学院博士学位论文 第三章 不同 日粮对人工瘤胃发酵参数与纤维素酶活性的影响 32 表 3不同 条件下人工瘤胃 度 (纤维素酶的动态变化 in 目 酸 00 乙酸 /丙酸 羧甲基纤维 素酶 (U/木聚糖酶(U/采样时间 日粮 50 100 150 50 100 150 50 100 150 50 100 150 50 100 150 0 50 100 150 合标准误 值来源 P 处理 为 试验组与其他处组相比，差异不显著 (P 试验周期 内 饲 喂 不同 日粮 瘤胃液 乙酸 、 丙酸和丁酸浓度 的 动态变化情况见表 4各 组瘤胃 液 度 在 饲喂 后 均显著上升， 2h4h 后 达到最高 值 ，然后 呈现 逐渐下降 的趋势，这一规律与人工瘤胃的试验结果一致 。在整个试验期内 对照组的 度 一直较低 ， 饲喂后 2h4h， 为负值的试验 组与对照组 相比 差异达到显著 水平 ( 在试验期内， 饲喂四种日粮后瘤胃内 主要 动态变化趋势为 饲喂 后各种挥发 性脂肪 酸浓度 均 开始上升，在 饲喂 后 的 4h6h 达到最高点，而后缓慢下降。 各 组 乙酸摩尔百分比 浓度 在饲喂后表现 为不同程度的下降，而丙酸的摩尔百分比浓度表现为上升。随着饲喂 时间的延长，这种趋势逐渐消失。 中国农业科学院博士学位论文 第四章 不同 粮对干奶牛瘤胃发酵与血浆子平衡的影响 37 表 4同 条件下瘤胃 、 酸、 丙酸和丁酸浓度 (动态变化 of in 目 N mg/酸 00酸 00酸 00样时间 粮 50 100 150 50 100 150 50 100 150 50 100 150 50 100 150 0 50 100 150 合标准误 值来源， P 处理 丙酸占总挥发性脂肪酸的 摩尔 百分比在饲喂后的 26h 与饲喂前相比均呈现不同程度 的上升，在随后 其他各时间点又逐渐恢复到饲喂前中国农业科学院博士学位论文 第四章 不同 粮对干奶牛瘤胃发酵与血浆子平衡的影响 39 的状态。各处理组丁酸和戊酸占总挥发性脂肪酸的百分比在各采样时间点无显著性差异(P 在试 验期内， 度的动态变化趋势见表 4从 度的变化看，各 处理组共同的变化趋势是在 饲喂 后 均 开始上升，并在 饲喂 后 的 4h6h 达到最高 浓度 ， 随 后逐渐下降， 并 维持在一个较 为恒定 的水平 在试验期内乙 酸 /丙酸比例的动态变化趋势见表 4各 组的乙酸 /丙酸的比值 在饲喂后逐渐下降，在 4h6h 降到最低，此时间点 乙酸 /丙酸比值与其他时间点相比，差异达到显著水平( 在饲喂后的 2h， 为 验组的 度显著高于对照组 (通过以上数据的分析可以看出 验组 日粮对 瘘管奶 牛 瘤胃的 和 有一定程度的影响。 反刍动物的瘤胃微生物主要包括细菌、原虫和真菌。人们发现瘤胃 细菌、 真菌 和原虫均 可分泌多种降解纤维 素的酶 ， 其中主要有纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、半乳糖醛酸酶等 13 种酶而在这些酶中 ， 研究最多的为木聚糖酶和纤维素酶。 瘤胃内纤维素酶活性受 和其他各种因素的影响，在本试验中可以发现，在饲喂后 4h、 6h，各 组瘤胃液的木聚糖酶活性与其他时间点相比 显著下降 (P 同 粮 对干奶牛血浆离子的影响 干奶期奶牛血浆中离子成分见表 4过对结果的分析 发现，饲喂不同 粮的奶牛，其血浆中的各种阳离子浓度没有明显 变化 (P 为 理组血浆中的氯 离子浓度显著高于对照组。各处理组血浆中的强离子差没有显著差异 (P 这主要是由于此阶段奶牛对各种离子的需求处于较低的水平，奶牛体内各种离子之间的动态平衡还没有被打破，因而各种离子的浓度都相对较高。这一结果与 998)的结果一致，在他的试验中，设计了不同来源的阴离子盐对干奶牛血气平衡 状况 及血尿离子平衡的影响，研究发现， 60 日粮处理组不 改变血清当中的各种离子组成。 表 4不同 条件下干奶牛血浆离子情况 in to in 目 粮处理组 50 150 Ca mg/ g a+ + a+K+ ) 国农业科学院博士学位论文 第四章 不同 粮对干奶牛瘤胃发酵与血浆子平衡的影响 40 注：相同列的数值肩标不同字母 (a， b， c， d)表明处理之间差异 显著 (一般研究认为，日粮中添加阴离子盐只 有 在奶牛临近分娩或分娩后，奶牛体内对钙离子的需求急剧增加的时候，才可以提高血清当中的总钙和离子钙浓度，而对干奶牛的影响却不是很显著，这一结果与 (1996)结果一致，但也 有 一些研究认为，日粮中添 加阴离子盐可以提高产前奶牛血清中的 总钙 和离子状态的钙 (1991)。 4 小结 着日粮阴离子盐添加量的加大， 为 试验组会对 瘤胃 和 度产生一定的影响，尤其是阴离子盐中含有非蛋白氮的条件下对 影响更为明显，但并不改变瘤胃的发酵模式。 过试验验三和四，我们可以发现，随着日粮阴离子盐添加量的加大， 为 试验组会对瘤胃发酵模式产生一定的影响，因此日粮 控制在 间或许会对瘤胃发酵的影响更小。中国农业科学院博士学位论文 第五章 阴离子盐和维生素 D 日粮对围产期奶牛血清离子、激素和酶的影响 42 第五章 阴离子盐 和 维生素 D 日粮 对 围产期奶牛血清 离子、 激素和酶的影响 减少奶牛代谢 性疾病的发生 ，特别是产奶早期的代谢疾病，是 奶牛养殖业主 、兽医人员和奶牛 营养 专家 的一项极其重要的任务。产 乳 热 (产犊时出现的 临床 低血钙症状 )是奶牛最常发生的代谢疾病之一。研究表明，产 乳 热奶牛 在 整个泌乳周期的产奶量会降低 14 ( 1984)。 几十年来，为了解决这一困扰奶业生产的难题，世界各国的奶牛营养专家采取了各种 预防 措施，例如 改变日粮 钙含量， 产前饲喂低钙日粮 ， 产前用维生素 D 注射 ， 产前 注射 甲状旁腺激素 (多种措施，但以上措施各有其弊端，很难在生产实际当中推广应用。众多 的试验表明， 在围产期 应用 阴离子 盐可以成功控制产后低血钙症状的发生。一般认为阴离子盐通过 降低体内酸碱平衡 来提高血钙浓度 。 而奶牛体内钙的代谢和调节受到众多因素的影响和制约，其中维生素 内外应用阴离子盐来提高血钙浓度的研究很少考虑到维生素 D 的作用，维生素 D 可提高小肠上皮细胞转运 P 的效率，并且增强甲状旁腺素的活性，提高骨钙吸收。这两项功能对于维持 P 的稳定至关重要。国外应用维生素 D 预防产乳热也取得了一定的效果， ( 1980)在产前 10d 14d 给奶牛注射高剂量的维生素D 可以减少产乳热发生，一般认为通过这种方式可以提高奶牛肠道对钙的吸收。但很少有人 同时 研究维生素 D 与 阴离子盐的互作效应， 本试验在本论文第 二章 试验内容的基础上 ，进一步探索应用阴离子盐与维生素 D 来提高血钙浓度的作用机制，研究两种机制的异同点。 1 材料与方法 验动物、日粮及饲养管理 试验地点选择在北京市大兴区沧达 农工商公 司，试验时间为 2005 年 10 月 2006 年 2 月。选用 40 头体重 ( 6002 0健康荷斯坦奶牛， 产奶量接近，胎次为 3 5 胎。 在距分娩25d 开始饲喂 试验日粮，将要饲喂的阴离子盐、维生素 D 与全部精料混合，按每头牛 每天 饲喂5行饲喂， 日喂 三 次 ，饲喂时间分别为早 8:00、下午 14:00 和晚上 20:00， 料 ，羊草每头牛 每天 饲喂 2由采食全株青贮玉米，试验期间奶牛自由 饮水。 同时跟踪监测尿液 ，观察排粪情况。每头牛的干物质采食量约在 10 13 /头之间。 试验牛单独集中到一起饲养管理 ， 产犊后转入产房挤奶 ， 并开始饲喂产奶初期日粮。 参考美国 001)奶牛营养需要， 以玉米、豆粕、麦麸 为 主要原料配 制 试验日粮，日粮组成与营养水平见表 5 验设计 本试验采用随机区组设计，选择 3 5 胎的健康荷斯坦干奶牛 40 头， 按照胎次和上一个产奶周期的产奶量接近得原则 分为 4 组， 试验共设计 4 个处理，分别为对照组、维生素 D 组 、阴中国农业科学院博士学位论文 第五章 阴离子盐和维生素 D 日粮对围产期奶牛血清离子、激素和酶的影响 43 离子盐 组 、维生素 D+阴离子盐 组 。 表 5验日粮组成及营养水平 of 目 粮 组别 料原料 (%， of 照组 生素 D 阴离子盐 生素 D+阴离子盐 米 8 58 麦麸 0 20 20 20 大豆粕 6 6 6 棉粕 2 12 12 12 石粉 酸氢钙 化镁 - 混料 1 1 1 1 阴离子盐 - - 5 5 营养水平 P (%) %) %) a (%) (%) g (%) a (%) (%) l (%) (%) (： 1 预混料含 8,000 mg/e; 2,400 mg/u; 8,000 mg/n; 15,000 mg/n; 200 mg/; 100 mg/e; 100 mg/o; 1000,000 IU/A; 200,000 IU/10,000 mg/E。 2 阴离子盐成分为 每种物质占精料的百分 比分别 3 据公式 M =(%+ (%K / (%(%S/计算得出 。 4 本试验日粮精粗饲料比 为 40: 60。 5 维生素 D、维生素 D+阴离子盐试验组奶牛每头牛 每天 通过饲料 额 外 补充 100000 单位罗氏公司生产的维生素 中国农业科学院博士学位论文 第五章 阴离子盐和维生素 D 日粮对围产期奶牛血清离子、激素和酶的影响 44 品采集 饲料样品的采集： 每 2 周 采集 一次 饲料样，采集量为精料 400g，羊草 400g，贮料采样称重后及时 65 烘干测定初水份， 所有样品在采样期末，混合均匀，四分法缩样，取约 500g 粉碎 ， 过 40 目筛 ，保存备用 。 血液样本的采集：分别在奶牛产前 7d、分娩 当天 和产后 7d 颈静脉处用真空采血管(血，一部分肝素 锂 抗凝用 于分离血浆，另一部分血液采集 后 立即放到冰水浴中，尽快转移到实验室， 4 3600r/m 离心 10分离 血清 ，按分析需要分装， 存备用。 定指标及分析方法 饲料样品分析 分、 P、 K 等指标。 测定采用 氏定氮仪按照 6432法测定、粗灰分 (6438水分 (6435标方法分析。中性洗涤纤维测定采用 1991)方法。 K 的分析采用原子吸收分光光度计(西电子，北京 )， P 用钒钼酸铵比色法测定 (杨胜， 2000)。 饲料中硫元素分析采用 17776酸钡沉淀法，氯离子分析采用 6439料中水溶性氯化物的测定方法。 )甲基蓝是一种优良的金属络合指示剂，在碱性缓冲液中与钙螯合形成一种蓝色复合物，此蓝色复合物的 颜色的深浅与钙的含量 成正比。在 610长下，分别测定标准管和样品管的吸光度值，计算钙的含量。 单一试剂法 )：磷酸与钼酸铵试剂反应，生成磷钼酸，被维生素 C 还原生成蓝色化合物 (钼蓝 )，再与同样处理的磷标准液比色求得血清中磷的含量。具体化学反应如下 ：(2123122312钼蓝 (清中镁与钙离子在碱性溶液中能与甲基麝香草酚蓝 (合生成蓝紫色络合物，在试剂中加入适量 与钙的亲和力强，使钙与 合而不能与 合产生蓝紫色从而消除了标准液中 镁的干扰，从而 使 镁与 成的颜色与标准比较在600测吸光度值，计算出样品中镁的含量。 氯试剂盒 氰酸汞比色法 )样品中的氯离子，与试剂中的硫氰酸汞反应生成可溶而不解离的氯化汞及硫氰酸根离子，该离子与试剂中的铁离子结合生成橙红色的硫氰酸铁，其颜色的深浅与氯的含量成正比。具体化学反应如下 ： 2g( 3(橙红色 )。 碱性磷酸酶试剂盒 率法 )：对硝基酚磷酸 +硝基苯酚 +磷酸底物是无色的，对硝基酚在 405强烈的吸收，其吸光度的变化率与碱性磷酸酶的活性成正比。降钙素：放免试剂盒 平衡法 )。血清羟脯氨酸：二甲氨基苯甲醛比色法 (试剂盒及测定仪器同上 )。血清甲状旁腺素：用放射免疫法测定，由中国原子能科学研究院提供试剂盒测定，仪器为中国科学院上海原子能四环仪器厂， 射免疫 钙素： (测定方法、试剂盒及测定中国农业科学院博士学位论文 第五章 阴离子盐和维生素 D 日粮对围产期奶牛血清离子、激素和酶的影响 45 仪器同甲状旁腺素 )。血清维 生素 D 的测定：高效液相色谱法，具体测定方法见附录。 据分析和统计 原始数据经 步整理后用 件中 块，进行多因素最小二乘均数及其差异显著性比较，统计模型为： (AP)ij+为群体平均值， 时间效应。 随机误差。 2 结果与分析 离子盐 和维生素 D 日粮 对围产期奶牛血清离子平衡的影响 表 5离子盐 和维生素 日粮 对血清 离子 含量 的 影响 he of on 项目 mg/ mg/ mg/ 钾 氯 强离子差 采样时间 粮 前 7d 对照组 生素 D 组 离子盐组 D+阴离子盐组 娩 当天 对照组 生素 D 组 离子盐组 D+阴离子盐组 后 7d 对照组 生素 D 组 离子盐组 D+阴离子盐组 合标准误 值来源 P 处理 间 1662 理时间 ：相同列的数值肩标不同字母 (a， b， c， d)表明处理之间差异显著 ( C、 天 显著高于处理 A、 B(血清中的维生素 D 含量 (见图 5 B、 含量在分娩前 7d 显著高于 A 组 ( D 组 血清当中的羟脯氨酸的含量在各时间点均显著高于 A， B 组 ( 离子盐 和维生素 D 日粮 对 围产期奶牛外周血淋巴细胞 影响 采用间接 法检测奶牛分娩前后热休克蛋白 达水平，检测结果见图 6图 6图中可见， 分娩 当天 与产前 7d 相比表达量明显升高，产后又逐渐下降，分娩 当天 与产前 7d 相比，两种蛋白表达水平均差异显著 ( 中国农业科学院博士学位论文 第六章 阴离子盐和维生素 D 日粮对围产期奶牛围产应激与免疫功能的影响 56 离子盐 和维生素 D 日粮 对围产期奶牛免疫功能的影响 离子盐 和维生素 D 日粮 对围产期奶牛 各类 免疫球蛋白量的影响 分离血 浆 ，测定血 浆 中免疫球蛋白 量变化情况 ，结果如 表 6 6 6图 6表和图中可看出围产期三类免疫球蛋白水平均下降，到分 娩时降到最低点，然后回升。从表和图中可看出，通过饲喂添加适量 维生素 D 的日粮可 缓解 此种情况。 表 6离子盐 和维生素 D 对各类免疫球蛋白总量的影响 he of on of g 日粮组别 目 样时间 前 7d 分娩 当天 产后 7d 对照组 生素 D 组 阴离子盐组 D+阴离子盐组 注： *与对照组比较 不能作为处于免疫抑制的指标， 各类免疫球蛋白总量也降低，这与围产期奶牛出现的免疫抑制现象有着直接的关系。通过本试验可以看出，提高日粮中的 含量对 围产期奶牛 T 淋巴细胞数和血清当中 免疫球蛋白 的 含量有一定的改善作用。通过对血清中维生素 D 含量进行分析发现，产前 7d 和分娩 当天 B、 D 处理组中的维生素 、 C 处理组，这说明血清中的维生素 D 含量与血清中免疫球蛋白的含量 和 T 淋巴细胞数目 存在一定的相关性。 一般认为维生素 D 促进体液免疫而抑制细胞免疫 (，1995)， 但也有研究认为对体 液免疫没有直接的影响 (2002)。 中国农业科学院博士学位论文 第六章 阴离子盐和维生素 D 日粮对围产期奶牛围产应激与免疫功能的影响 61 最近研究发现：维生素 D 是一种新的神经内分泌 细胞免疫具有重要的调节作用，主要表现为对单核巨噬细胞、 T 淋巴细胞、 B 淋巴细胞，以及胸腺细胞增殖分化的影响和这些细胞功能的影响等 (1992)。研究发现，维生素 D 受体可以激活 T 细胞，以及激活巨噬细胞合成 1,25(免疫细胞的分化和增殖均有免疫调节的作用 (2002)。1,25(抑制原核细胞增殖而间接刺激单核细胞增殖，促使单核细胞向吞噬作用的巨噬细胞转化，然后 将加工处理的病原体传递给辅助 T 淋巴细胞，增强 干扰素合成，干扰素又刺激巨噬细胞产生 1羟化酶，生成 1,25(正反馈效应。在单核巨噬细胞系统中，1,25(仅可使正常外周血单核细胞向巨噬细胞分化，而且可以加强单核巨噬细胞的免疫功能 (2002)。并能促进单核巨噬细胞或调节被激活的 T 细胞产生白细胞介素(、 2、 3、 6 和肿瘤坏死因子 (、 。 1,25(乏，外周血 T 淋巴细胞总数及 于 T 辅助细胞减少而导致 值下降。 T 辅助细胞主要功能是分泌细胞因子，诱导和增强 T、 B 细胞及巨噬细胞的免疫应答，其数量的减少直接导致了细胞免疫功能降低，亦使 B 细胞分化和成熟障碍，导致低免疫球蛋白血症，以致免疫功能降低(李晓玲， 1998)。 4 小结 娩 当天 与围产应激 有关 的激素含量发生明显的变化，血清皮质醇含量与 达含量的的升高具有相同的趋势。 过外源 形式补充维生素 D，可以缓解因围产应激造成的免疫球蛋白下降现象。 过外源的形式补充维生素 D 和阴离子盐，可以缓解因围产应激造成的外周血淋巴细胞下降现象，改善围产期奶牛的免疫功能。 中国农业科学院博士学位论文 第七章 阴离子盐和维 生素 D 日粮对围产期奶牛健康和生产性能的影响 62 第七章 阴离子盐 和 维生素 D 日粮 对围产期奶牛健康和生产性能的影响 奶牛产前的最后几周胎儿和胎盘对营养物质的需要迅速增加 (1995)，产后由于泌乳的开始，初乳的合成以及乳产量的迅速增加， 使得大量的营养物质随牛奶排出。 增加了乳