【毕业学位论文】（Word原稿）传染性喉气管炎病毒gD、gE、gJ基因的表达与间接ELISA方法的建立预防兽医学论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士 学位论文 传染性喉气管炎病毒 因 的表达与间接 法的建立 、 E of 、 E of I 摘 要 禽 传染性喉气管炎 (鸡 的一种 以呼吸困难、咳出血样黏液、喉部和气管黏膜水肿 出血并导致糜烂为 主要 特征 的病毒性呼吸道传染病 ，可 致 感染鸡的死亡和产蛋下降 ， 是危害养禽业的重要疫病之一。 传染性喉气管炎病毒 (毒和弱毒疫苗 都可以造成潜伏感染， 成为传染源， 使本病持续存在，并形成区域流行。 本研究 通过表达 个重要结构蛋白并纯化和建立间接 法， 以 筛选合适的诊断抗原并建立间接 法，用于 血清学检 测。 本研究首先克隆和 测序了 G 株 因， 整开放阅读框大小为 2988比 多 30推测 编码的氨基酸序列单独形成一个表位。随后， 通过 增出 重要囊膜糖蛋白 主要抗原性区域，连接到 原核表达载体 )中， 经 导在 表达， 三重组蛋白 有可溶性蛋白存于上清中 ， 经克隆抗体鉴定后， 非变性条件下用 脂纯化 性血清 和制备的兔抗 因子 血清 证实 保留了 抗原性 。 然后 ， 对纯化 的 行了间接 件 的探索， 优化 抗原 浓度，血清稀释度，酶标二抗稀释倍数和封闭液； 根据 36 份 性血清 ，按 阴阳性临界值 =阴性血清 3 确立 了 接 定标准；完成了特异性试验和符合性试验 ， 接 139 份血清样品的检测结果 与全病毒间接 符合率分别为 对试验感染 G 株的 血清进行 检测， 接 能检测出明显的抗体变化曲线 ， 其中 接 够更合理的反映 根据 试验结果， 我们选择 毒感染 的血清抗体检测原，并确立了间接 法。 本研究筛选 原 ， 确立 间接 法， 为 毒感染与弱毒疫苗免疫的血清检测提供基础。 关键词 传染性喉气管炎病毒 ， 糖蛋白 糖蛋白 糖蛋白 间接 is an of by of to a to a or or . in to of In in to In G on gJ a 98830bp a in . , E . A of in is is of by by at of as to to , by 6 39 In G of in a on we In we as an or ， ， ， 录 第一章 绪论 . 1 . 历史与 分类地位 . 1 基本结构 . 1 理化特征 . 2 生物学特征 . 2 免疫学特征 . 3 子生物学研究进展 . 3 因组结构 . 3 转录 . 3 复制 . 4 要功能蛋白的特性 . 6 染和致病的分子机制 . 10 分子检测技术 . 11 基因工程疫苗 . 12 研究目的与意义 . 15 第二章 蛋白 部分表达 . 16 料与方法 . 17 质粒、细胞、病毒和实验动物 . 17 试剂和抗体 . 17 主要仪器 . 17 因的克隆 . 17 因序列分析与比较 . 18 蛋白 分表达载体的构建 . 18 重组蛋白 析 . 19 重组蛋白 析 . 19 重组蛋白 纯化 . 19 纯化重组蛋白的 析 . 20 兔抗 因子 血清的制备 . 20 果 . 20 因扩增 . 20 因序列分析与比较 . 21 原性分析与引物设计结果 . 22 增结果 . 23 达载体鉴定 . 24 重组蛋白 果 . 25 重组蛋白 果 . 26 重组蛋白 化结果 . 26 纯化重组蛋白的 果 . 28 兔抗 因子 血清制备结果 . 29 讨论 . 29 第三章 接 法的建立 . 31 料与方法 . 32 实验动物、试验血清和病毒 . 32 主要仪器与试剂 . 32 溶液的配制 . 32 重组蛋白 制备和纯化 . 32 酶标二抗最适稀释度的确定 . 32 抗原最适包被浓度与阴阳性血清最适工作浓度的确定 . 33 封闭液的选择 . 33 重组蛋白间接 序的确定 . 33 间接 定标准的制定 . 33 特异性试验 . 33 符合性试验 . 33 试验感染 血清抗体变化 . 34 果 . 34 酶标二抗最适稀释度 . 34 抗原最适包被浓度与阴阳性血清最适工作浓度 . 34 最适封闭液 . 35 重组蛋白间接 序 . 35 间接 定标准的制定 . 35 特异性试验结果 . 36 符合性试验结果 . 37 试验感染 血清抗体变化 . 37 讨论 . 38 第四章 全文结论 . 40 参考文献 . 41 附 录 . 45 致 谢 . 49 作者简历 . 50 V 图表清单 图 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 . .G . .G株 .G株 .与 白抗原性比较 抗原性分析 结果 23 因部分表达的 增结果 24 重组质粒的双酶切鉴定 .组蛋白的 果 . .组蛋白的 .组蛋白 .组蛋白 纯化 结果 组蛋白 化后薄层扫描 .组蛋白纯化后的 .组蛋白纯化后与 抗的 果 .抗 因子 血清抗体 G 株试验感染鸡血清抗体变化趋势 . 表达引物 . 23 上清中重组蛋白含量的表达条件优化 .组蛋白纯化条件优化 .接 标二抗最适稀释度的确定 .适抗原包被浓度与阴阳性血清最佳稀释度 .接 适封闭液 . .接 数的确定 .接 阴阳性判定标准 . 35 接 叉试验 接 争抑制试验 接 全病毒间接 符合性试验结果 .G 株 试验 感染鸡血清抗体变化趋势 .文缩略表 英文缩写 B R E R S 英文全称 50% 文名称 禽流感 牛血清白蛋白 鸡传染性贫血 马疱疹病毒 I 型 半数鸡胚感染量 酶联免疫吸附 实 验 鸡痘病毒 传染性支气管炎 传染性法氏囊病 传染性喉气管炎 传染性喉气管炎病毒 内部反向重复序列 新城疫 开放阅读框 伪狂犬病毒 聚乙烯醇 禽网状内皮组织增生症 标准方差 无特定病原体动物 末端重复序列 长独特区 短独特区 中 国 农 业 科 学 院 硕 士 学 位 论 文 第 一 章 绪论 1 第一章 绪论 传染性喉气管炎 (鸡的一种 急性 病毒性呼吸道传染病 ， 在世界范围内爆发 ， 严重流行时发病率达 100%， 致死率可 高达 70%， 由 传染性喉气管炎病毒 (起 ， 以呼吸困难、喘气、咳出血样黏液、喉部和气管黏膜水肿、出血并导致糜烂 等 为 主要 特征 ， 可 致 感染鸡的死亡和产蛋下降 ， 造成严重的经济损失 ， 是危害养禽业的重要疫病之一 (2005)。自 1925 年 美国洛岛发现本病以来，现已遍及世界各国。我国在 50 年代发现本病， 19881990 年曾在许多省份流行， 1992 年以后在我国一些地区又呈地方性流行。目前国内外使用的 毒疫苗毒力偏强，接种后反应大；能引起潜伏感染 (1986)；弱毒疫苗株在鸡群中传播可能引起毒力返强 (et 1991)，而成为潜在的传染源 (et 1989, 1990； et 2006)；因此，该疫苗仅限于流行地区使用，清净鸡群一旦发生本病将引起 发，导致重大损失，所以本病的防制已成为世界养禽业面临的难题。 历史与 分类地位 传染性喉气管炎 首次报道于 1925 年，但也有报道认为本病可 能出现更早。 1931 年，美国兽医协会禽病专业委员会采纳了 传染性喉气管炎 这一病名。 1937 年首次证明此病病原为一滤过性病原。本病是第一个研制出有效疫苗的家禽的主要病毒性疾病 (et 2005)。 传染性喉气管炎病毒 ， 属于疱疹病毒科的 分类学上被确定为 。 基本结构 球形有囊膜的病毒，主要由核心、衣壳、皮层和囊膜组成。核心由病毒双股 合蛋白相互缠绕而形成圆柱形，病毒核心内因 含病毒 子密度高。核心外是直径约 100衣壳，呈 20 面立体对称，外观呈六边形，由 162 个呈放射状排列且有中空轴孔的壳微粒 (成，壳微粒的主要成分是多肽。核心加上衣壳，称为核衣壳，是裸露的病毒粒子，在细胞核内呈散在或结晶状排列 (殷震 等 , 1997)。在核衣壳周围为一层由球状蛋白组成的颗粒带，称为皮层 (皮层在超薄切片中无明显特征，但在负染时呈纤维样结构 (金奇 , 2001)。皮层外包裹着囊膜，囊膜主要由脂蛋白组成，超微结构研究确认囊膜是皮质化的核衣壳包裹入高尔 基体反面网状结构内的囊泡时获得 (et 2002)。囊膜表面有很多突起，这些突起由病毒编码的糖蛋白组成。成熟病毒粒子的直径为 19550结构如图 1。 中 国 农 业 科 学 院 硕 士 学 位 论 文 第 一 章 绪论 2 图 1构示意图 自 et 2002） 理化特征 浮密度为 毒基因组为线性双股 子 ， 子量为 100106，长度 为 150 基因组的（ G+C）含量为 45%，是疱疹病毒科（ G+C）含量最低的病毒，由反向重复序列将其分成一个长独特区和一个短独特区，呈现两种异构体。 病毒对脂溶剂和各种消毒剂敏感。病毒经乙醚处理 24h 后即失去传染性。 3%的来苏儿和 1%的苛性钠在 1可以使病毒迅速灭活， 5%的过氧化氢喷雾熏蒸畜舍设备可以完全杀灭病毒。病毒对热敏感， 55 15 38 48h 很快失去感染性。紫外线、 X 射线和 射线也很容易使病毒灭活。 生物学特征 有高度的宿主特异性，只能在鸡胚及鸡胚的细胞培养物内良好增殖。目前，鸡胚仍是常用的病 毒培养方法，经尿囊腔或绒毛尿囊膜途径接种病毒，接种鸡胚后 3648h，以包涵体染色法检测时，可在被感染的外胚层细胞内发现典型的核内嗜酸性包涵体。将病毒适当稀释后接种鸡胚，能在绒毛尿囊膜上观察到散在的边缘隆起、中心低陷的痘斑，接种后 212d 鸡胚死亡，受感染的鸡胚存活时间随传代次数的增加而缩短。 病毒可在鸡胚肝、鸡胚肺、鸡胚肾以及鸡肾细胞培养物中增殖，其中，鸡胚肾是较好且通常使用的培养系统。 病毒感染细胞后，可以产生明显的细胞病变，细胞的折光性增强，细胞膨胀，染色质移位，核仁变圆，细胞融合形成多核巨细胞。病毒可 通过细胞间桥扩散，最终病毒释放导致细胞破坏。 病毒不能在鸡胚成纤维细胞中繁殖。 可以在 胞系上复制和传代 (et 2005)。 胞系是一株来源于经二乙基亚硝胺诱导的鸡肝癌细胞系，可以表达葡萄糖 有微小管 活性。但病毒在胞上需要适应，因此不适合于病毒的初步分离诊断。 中 国 农 业 科 学 院 硕 士 学 位 论 文 第 一 章 绪论 3 复制是一复杂而有序的过程。病毒基因的转录由一个高度有序的级联调控机制所控制，以滚环模式复制。病毒基因的转录、复制和衣壳的组装均在细胞核内进行，成熟的核衣壳从细胞核释 放到胞外存在一个囊膜化 再囊膜化的过程 (et 2002)。 码多种参与核酸代谢（胸苷激酶、 、核糖核苷酸还原酶）、 成（如聚酶、解旋酶、引物酶）和蛋白质加工（如蛋白激酶）的酶和蛋白质，并参与病毒大分子合成的调节 (金奇 , 2001)。 引起鸡的急性原发感染，并于急性感染的后期在鸡的三叉神经节处建立潜伏感染。潜伏感染时机体内没有感染性病毒粒子的存在，但可在神经细胞的细胞核内发现以闭和环状形式存在的病毒基因组和部分转录产物。潜 伏感染可以被外来刺激因素激活而发生复发性感染。 免疫学特征 鸡感染 ，将产生一系列的免疫应答。 57d 可在感染鸡的血清中检测到病毒中和抗体，21d 时达到高峰，然后逐渐下降至低水平，并且在此水平上维持一年多的时间。感染后大约 7d，在气管组织及其冲洗液中，能检测到粘膜抗体和低水平的中和 体 (1986; et 1989)。 发现， 染后 37d，气管中的 成细胞大量增加 (et 1989)。 用法氏囊切除研究表明：粘膜抗体对免疫鸡抑制病毒不起作用，主要的保护性机制是气管处的细胞介导的免疫应答引起的 (et 1983 )。 证实 引起迟发性变态反应 (et 1990)。大量的现地和实验室试验都表明，血清抗体的滴度与免疫鸡群的免疫状态几乎无相关性，对 毒攻击的免疫保护与血清抗体无关。虽然病毒特异性的抗体与免疫保护不相关，但可以用于本病的血清学诊断，包括病毒中和实验，琼脂扩散实验，间接免疫荧光实验和酶联免疫吸附实验。 子生 物学研究进展 因组结构 因组是典型的 小为 150 一个长独特区 (一个短独特区 (成，在短独特区两端排列着一个内部反向重复序列（ 末端重复序列（ 长独特区和短独特区的大小分别为 108 12 内部反向重复序列和末端重复序列的大小都为 15 图 1(et 2003), 两个反向重复序列及其中间的短独特区可以沿轴旋转 180 度，这样使病毒的基因组呈现两种异构体。 转录 感染细胞 中 的转录受细胞 聚酶 病毒蛋白的 调 控，转录产物的 生 成有时序上的先后，呈高度有序的级联机制。按时序的先后，把病毒的转录分为 a、 、 三类。 中 国 农 业 科 学 院 硕 士 学 位 论 文 第 一 章 绪论 4 图 1 自 et 2003） 注： 传染性喉气管炎病毒 的基因组结构。基因组 大小为 150 反向 重复序列（ 被其分隔的长独特区（ 短独特区（ 成。 病毒 a 基因转录产物最先在细胞内 生成 ，约在感染后 24h 达高峰。病毒可能有多种 a 基因转录产物，大部分有调节作用，指导病毒 和 基因的表达。环己酰亚胺洗脱 试 验鉴定了单一的a 蛋白，此蛋白在去掉蛋白合成抑制剂后大量表达；而在病毒蛋白合成的时间曲线中却没有检测到，这种结果和伪狂犬病毒的单一以及马疱疹病毒的四个 a 蛋白相似。这种现象暗示疱疹病毒的a 基因仅在病毒感染后表达了很短的时间或是在病毒复制时表达量低到此方法无法检测到。同时，此实验也揭示，在蛋白合成阻抑的细胞内，病毒 a 录产物积聚，也说明了 a 基因转录的下调是受 a 基因的产物所控制 (et 1992)。 病毒 基因产物为 基因受