【毕业学位论文】（Word原稿）秸秆腐熟菌剂的细菌种群分析及其腐熟过程的动态研究微生物分子生态学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士学位论文 秸秆 腐熟菌剂的 细菌 种群分 析 及 其 腐熟过程的 动态研究 in in I 摘 要 本论文以秸秆腐熟菌剂为研究对象，分别采用 分子生物学方法和 传统平板分离方法对其细菌 菌群及在腐熟过程中的变化 进行分析。 采 用 构建 16S 隆文库 的方法比 传统平板分离方法能够更加客观、准确的反应 腐熟剂 样品 中 细菌组成 ， 术 是目前 研究 接种微生物 在腐熟过程中 动态 变化 的理想方法之一。本 论文 研究可为 秸秆腐熟 菌剂的 菌种 合理组成、 菌剂 生产 与 应用提供依据 。 论文的主要结果如下。 采用 构建 16S 隆文库的方法研究 了 目前广泛应用的 样品 A 和 B 的细菌组成， 结果 表明 样品 A 主要是融合乳杆菌（ 枯草芽孢杆菌（ 短小芽孢杆菌（ ； 而 样品 B 主要是布氏乳杆菌（ 香肠乳杆菌（ 耐酸乳杆菌（ 。 对比平板分离法， 采用构建 16S 库的方法 得到的结果 更全面， 也更好反映出 样品 中 的细菌组成。 堆沤和凼沤 这两种发酵方式的优势微生物存在较大的差异。但是 都是堆沤方式的两个样品 的 目的条带 测序结果与产品建库测定结果相比较，测序结果均非所加 秸秆腐熟剂 优势细菌 。 将样品 A 和 B 接种 水稻 秸秆 小型 堆 肥 中 ， 采用 方法和平板培养的方法分析堆肥中的微生物动态变化，并测定 堆 腐过程中的温度、 、含水量、 C/N、种子发芽率等 参数 。 实 验结果表明，添加 秸秆 腐熟剂可以促进堆肥顺利进行 ； 堆肥中微生物发生明显演替，首先是乳酸菌和常温细菌大量繁殖， 促进 堆温升高，进入高温期后高温放线菌和高温细菌 快速 繁殖，在腐熟后期堆温下降后，常温菌又重新繁殖。 采用 谱分析其过程中优势微生物， 结果表明 堆 腐 过程中不同时期 是不同 优势菌种扮演重要角色 以 促进秸秆顺利腐熟。 并 且目的条带测序结果表明，堆肥中优势菌种大多为目前不可培养微 生物，并非 添加 样品中所含 优势 微生物 。 本研究表明 ： 16S 隆文库法 和 可以用于微生物菌剂中的细菌组成分析， 快速准确检测菌剂质量，这 对于微生物菌剂质量的提高，推进微生物肥料行业的可持续发展具有重大意义 ； 堆肥过程 是由多个不同菌群主导的 接力 过程 ， 腐熟剂对初期的腐熟温度的提高起到关键作用 ， 随着腐熟进程的深入，微生物菌群发生了更替 。 方法适 合 大批量 提取。 方法分析 复杂微生物样品需要通过垂直电泳先确定变性 剂浓度的大致范围。 关键词 ： 秸秆 腐熟剂； 16S 隆文库； 菌组成； n of by 6S is is of to of in of of of of as 6S of of of 6S in of of of of s of At we as pH, of go on in of at to at of of in of in t in 16S be in of of NA be in 16S 录 第一章 绪 论 . 1 秸秆及其应用现状 . 1 秸秆还田与堆肥化处理 . 3 秆堆肥化处理 . 3 肥重要影响因素 . 4 秸秆腐熟菌剂研究进展 . 6 堆肥中的微生物生态学过程 . 8 分子生态学在微生物多样性研究中的应用现状 . 9 增与多态分析及核苷酸序列分析 . 9 . 9 本论文研究的意义和目的 . 11 本论文研究的内容、方法和技术路线 . 11 论文研究内容和方法 . 11 论文研究所采用的技术路线 . 12 第二章 16S 隆文库法分析秸秆腐熟菌剂细菌组成 . 13 实验材料 . 13 秆腐熟菌剂 . 13 要仪器设备 . 13 研究所用的其它菌株、质粒和引物 . 13 养基 . 14 冲液和试剂 . 16 取试剂 . 16 实验方法 . 17 提取 . 17 度与纯度的测定 . 18 6S 增及 物纯化 . 18 物的连接 . 19 化 . 19 阳性克隆的筛选 . 19 型 . 20 建克隆文库 . 20 结果与分析 . 21 品总 取结果 . 21 6S 增结果及 增结果 . 22 性克隆的筛选与检测 . 23 型结果 . 23 建克隆文库结果 . 25 个样品组成菌株的系统发育树状图 . 27 用菌落平板计数法测定的样品结果 . 30 本章小结 . 31 第三章 腐熟过程的细菌动态变化研究 . 32 实验材料 . 32 样 . 32 要仪器及试剂 . 32 实验方法 . 32 提取方法 . 32 6S 增及 物纯化 . 33 . 33 泳 . 34 结果与分析 . 35 取结果 . 35 6S 增 . 35 果 . 36 直电泳变性剂浓度的确定 . 36 个样品的 析结果和主要目的条带的测序 . 37 本章小结 . 38 第四章 水稻秸秆的小型堆肥试验 . 39 实验材料 . 39 稻秸秆和秸秆腐熟菌剂 . 39 V 要仪器和试剂 . 39 实验方法 . 39 肥实验处理 . 39 腐过程测定的参数及其测定方法 . 40 板计数法分析堆肥微生物 . 41 肥样品 取 . 41 肥样品 谱 . 42 结果与分析 . 42 料的基本理化特性 . 42 肥外观效果 . 42 肥各参数变化 . 43 板培养法测定堆肥微生物的结果 . 45 析结果 . 49 本章小结 . 52 第五章 结论与讨论 . 54 结论 . 54 讨论与展望 . 55 参考文献 . 56 致 谢 . 60 作者简历 . 61 文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 性梯度凝胶电泳 基对 氧核糖核酸 磷酸脱氧核糖核酸 二胺四乙酸 化乙锭 丙基 千碱基对 合酶链式反应 二烷基硫 酸钠 醋酸 冲液 （羟甲基）氨基甲烷 苄青霉素 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 1 第一章 绪 论 我国是农业大国，各类农作物秸秆资源十分丰富，秸秆年产量达 7 亿多吨 （孙永明等， 2005）。随着农村经济的发展和农村能源问题的解决，秸秆不再作为燃料，农作物在收割季节秸秆被集中燃烧的现象日益突出，不仅污染环境，危害人们的身体健康，而且烟雾弥漫，影响陆路交通和 飞行安全。因此，合理的开发利用农作物秸秆显得尤为重要。 秸秆还田 作为 一项重要的农业管理措施，可以增加土壤有机碳的含量，而土壤有机碳水平的提高不仅是土壤肥力上升的重要指标，同时也是目前全球变暖条件下，如何利用土壤碳截留减缓温室效应所追求的一个目标，因此，秸秆还田具有重要的生产和生态效益（张庆忠等， 2006） 。 但 由于农作物秸秆主要由纤维素 、 半纤维素和木质素三大部分组成，自然状态下难以被微生物分解 ， 所以秸秆直接还田后在土壤中被微生物分解转化的周期长，不能作为当季作物肥源 。 此外， 在土壤有机质转化过程中，秸秆还田后如果 碳氧比不适当 (一般土壤中 C： N=10： 1 或 11： 1)，微生物分解有机质时， 会 争夺土壤中的氮素，产生土壤与作物争 氮现象。 而 将秸秆进行堆肥后制成复合有机肥料 再还田 ， 则可以 克 服上述问题，不仅 可以 为农田提供大量优质的有机肥料，而且为农村解决秸秆问题找到了一条无害化、资源化、变废为宝的合理出路，因而具有很好的经济效益、环境效益和社会效益。 为了加快秸秆堆肥腐熟过程， 接种 秸秆腐熟剂 是一种必要的，也是行之有效的技术措施。要保证所使用的 秸秆腐熟剂 的促 进 腐 熟的功效 ， 合理的菌群组成是前提。开展秸秆腐熟剂菌群组成的 研究 及其动态变化 必不可少，具有重要的指导意义。 秸秆及其应用现状 我国是世界农业大国，许多农作物的总产 已 居世界前列，各种秸秆资源来源广泛，数量巨大，据估算约有 七亿 吨之多，是一项宝贵的农业资源。长期以来，农作物秸秆在农民生活和工农业生产中充当着重要的角色，农民靠它建房蔽日遮雨，烧火做饭取暖，养畜积肥还田 ;同时，秸秆还是造纸业的主要原料。但随着农村经济的发展和农村能源问题的解决，出现了秸秆严重过剩的现象。在我国的一些玉米、小麦和水稻产地，每年夏秋季在收割季节的秸秆被大量焚烧，并且这种农作物秸秆被集中焚烧的现象日益突出 。其恶果是 :破坏了生态平衡，造成土壤肥力衰竭，污染了环境 ;秸秆燃烧能利用率极低 (在 10% 以下 )，浪费很大（ ， 2002）。不仅污染环境，危害人们的身体健康，而且烟雾弥漫，影响陆路交通和飞行安全。除了秸秆不再作为燃料外，随着化肥施用量的增加和各种配合饲料的大量使用，农民不再愿意费事费力用秸秆制作农家肥或当作饲料，而是直接使用化学肥料和精饲料，导致秸秆用作肥料和饲料的用量也越来越少。另外，秸秆作为工业原料的数量也在减少，其它方面的用量如建材等需用秸秆的量也没有很大幅度的增加（陈展，2005）。因此， 随着农村经济的发展，秸秆相对过剩这己成为一个全国性的问题。 随着人口的增长和人民生活水平的不断提高，能源危机、食物短缺、环境污染等问题正日益严重地困扰着整个世界，寻找开发新能源、节省粮食、减少环境污染的有效途径，显得越来越重中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 2 要。而纤维素类物质是世界上最丰富 (占全球总生物量 80%)、最廉价的资源之一，也是地球上最丰富的可再生资源。植物通过光合作用使光能以生物能的形式固定下来，其生成量每年高达 1000亿吨，这些能量相当于全球人类每年能源消耗量的 20 倍，食物中所含的能量的 200 倍，而且这些生物能可以年复一年通过自 然界的物质循环生成，是永远不会枯竭的可再生资源（黄莉， 2006）。 秸秆主要由纤维素、半纤维素和木质素三大部分组成。纤维素是葡萄糖以 糖苷键结合形成的高分子化合物，包括葡萄糖单位 2000。 其葡萄糖亚基排列紧密有序，形成类似晶体的不透水的网状结构，以及分子间结合不甚紧密、排列不整齐的无定形区域。 纤维素和半纤维素属多糖物质，是微生物所需要的能源和碳源。在适宜条件下，通过微生物的作用，只需几周的时间就能分解掉其总量的 60 木质素是芳香族化合物通过取代基以醚键和 联结形成的高度无 规则三维生物大分子物质。合成木质素的单体有三种 ,三类木质素结构单元连接相似，由于分子大 (相对分子质量 05)，溶解性差，没有任何规则的重复单元或易被水解的键，所以木质素分子结构复杂而不规则，由于含有各种生物学稳定的复杂键型，因而微生物及其分解的胞外酶不易与之结合。与其他成分如纤维素、半纤维素等降解物不同，木质素不含有易水解而重复的单元，并且对酶的水解作用呈抗性，是目前公认的微生物难降解的芳香族化合物之一。 纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称。一般将纤维素酶分为三类 ：（ 1） 内切葡聚糖酶 (也 称 或 )，这类酶作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机水解 一糖苷键，将长链纤维分子截断，产生大量非还原性末端的小分子纤维素 ；（ 2） 外切葡聚糖酶 (也称 )，这类酶作用于纤维素分子的非还原端，依次水解 一糖苷键，每次切下一个纤维二糖分子 ；（ 3） 纤维二糖酶 (也称 一葡聚糖苷酶 )，这类酶水解纤维二糖和短链的纤维寡糖生成葡萄糖 (杜秉海等， 1995)。目前，普遍接受的酶解机制是协同作用模型（ 等， 1990） ，认为在协同降解过程中，首先由 在纤维素聚合物的内部起作用 ，在纤维素的非结晶部位进行切割，产生新的末端，然后再由 以纤维二糖为单位，从末端进行水解，最后由 前，国内外有关微生物对纤维素的降解研究很多。国外在微生物对木质纤维素降解方面的研究以单个种属微生物 (如白腐真菌、木霉、曲霉等 )的添加为主，而对同时添加多种微生物研究的较少。 国内研究方向主要集中在 纤维素分解菌 新菌株的选育及产酶调控机理等实际生产应用方面。 如何将过剩的秸秆转化为人类可利用的能源或物质，一直是中外学者关注的课题。当前秸秆的处置现状主要有 :(1)机械化秸秆直接 还田：秸秆直接还田可增加土壤有机质含量、培肥土壤，对农业的可持续发展有重要意义。 (2)秸秆肥料化：将秸秆进行堆肥，利用微生物的分解作用将大分子长链的有机物转化为小分子的葡萄糖、氨基酸、脂肪酸等，并最终转化为可被植物、动物吸收和利用 无机盐类等。堆肥产物作为有机肥料直接使用，将是今后秸秆高效利用的有效途径之一。 (3)秸秆饲料化：秸秆通过青贮、氨化、膨化、压块和微生物发酵等多种方式制成饲料，用于养殖。 (4)秸秆制生物蛋白：利用微生物分解纤维素并吸收分解产物为其生长营养，而后随微生物体的 增殖，蛋白质 的 量增加。这样 就 可变 废 纤维素为饲料，甚至食品。将这项技术用于解决粮食短缺，会有很好的前景。 (5)秸秆气化：使秸秆在缺氧的情况下进行燃烧，产生一氧化碳、氢气、甲烷等可燃气体，再通过输配系统，输送到各家各户，用于炊事用能。 (6)以秸秆为原料养殖食用菌：利用秸秆中含有的丰富纤维素和木质素等有机物培育食用菌 ， 既能获得较高的经济效益，其培养基又可作优质的有机肥。 (7)工业原料：利用秸秆制造乙醇、淀粉等化工业的原中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 3 料。但是尽管秸秆有上述种种利用途径，目前对纤维素资源的利用大约只占地球上总储量的 之所以 利用率如此之低，主要是秸秆成分 纤维素水解为单糖这一关键性步骤受纤维素特殊的构造所阻碍（张亚宁， 2004）。这不仅造成极大的资源浪费，甚至对环境造成污染。 秸秆还田与堆肥化处理 我国农民对作物秸秆的利用有 悠 久的历史，只是由于从前 的 农业生产水平低、产量低，秸秆数量少，秸秆除少量用于垫圈、喂养牲畜，部分用于堆沤肥外，大部分都作燃料 焚烧 。 随着农业现代化的迅猛发展 ,秸秆还田特别是直接还田越来越受到重视。一方面是大规模的农业生产 ， 秸秆需要就近处理 ,以节省劳力 ； 另一方面 ， 长期单纯施用化肥不利 于 土壤肥力的发育 。在传统的农业耕作实践中 ， 作为作物所需要养分的给源和土壤的改良剂 ， 秸秆一直都被腐解后施入农田。但在自然条件下 ， 由于我国人均占有耕地少，复种指数高，倒茬间隔时间短，加之秸秆碳氮比高，不易腐烂。所以秸秆还田常因翻压量过大，土壤水分不适，施氮肥不够，翻压质量不好等原因，出现妨碍耕作，影响出苗，烧苗，病虫害增加等现象，有的甚至造成减产。 因此秸秆直接还田目前只能用于少量秸秆的还田（史央， 2002）。而 将农作物秸秆经堆肥化处理 后 ， 再 将 堆肥产物 作为有机肥料 再还田 ， 则 是处理农作物秸秆的有效方法之一。农作物秸秆经堆肥化处理后 有以下优点：易分解的有机物大部分分解；施入土壤后不产生氮的生物固定；通过降解除去酚类等有害物质，消