【毕业学位论文】（Word原稿）土壤中溶无机磷细菌的分离、鉴定及阴沟肠杆菌溶无机磷基因的克隆微 生 物 学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 土壤中溶无机磷细菌的分离、鉴定及阴沟肠杆菌溶无机磷基因的克隆 of of 摘 要 溶磷微 生物在土壤中磷循环相关的生物学系统中担任着重要的角色 , 它可以将难溶磷素转化为可溶性磷，提高磷肥利用率，本论文围绕溶磷微生物开展相关工作，取得以下结果 ： 本实验从北京部分地区采集 4种土样分离纯化出 30株溶解无机磷的细菌，对分离的细菌和本实验室保藏菌株（ 22株）进行溶无机磷定性和定量的筛选，对其中编号为 株细菌利用 结果表明 ,而 其中的 定其 16S 果也表明该菌株在分类上归属阴沟肠杆菌（ 选取 座子进行三亲本杂交，构建了约 20， 000个接合子的突变文库，并进行了相关的筛选工作，经过多种方法没有筛选到溶无机磷的突变菌株，推测控制细菌溶无机磷的性状因素较多，需要新的方法挑选该类表型的突变 。根据已发表的溶无机磷的基因增出该基因的核心片段 582分析与其他细菌中的该基因核苷酸的最高同源性 85%，将该片段标记后经 证 关键词 ： 溶无机磷细菌， 16S 座子，溶无机磷基因 in an in of SM as In 30 of of of 2 of in in of of 6S n5 no 0,000 by by to of on of in 82bp CR 5% IG as in NA 16S 目 录 第一章 绪论 . 1 究意义 . 1 究现状 . 1 菌种群的现代鉴定技术 . 8 因克隆技术 . 10 究目的及 技术路线 . 12 第二章 土壤中溶无机磷细菌的筛选 . 14 料 . 14 法 . 15 果 . 16 论 . 19 第三章 部分溶无机磷细菌的鉴定 . 21 法 . 21 果 . 27 果 . 29 论 . 29 第四章 溶无机磷细菌突变库的建立 . 31 料 . 31 法 . 31 果与讨论 . 33 第五章 因的克隆 . 35 料 . 35 法 . 36 果 . 42 论 . 44 第六章 结论 . 45 参考文献 . 46 致 谢 . 53 附录 培养基及制法 . 54 附录 部分试剂 . 56 附录 生物自动鉴定分析结果 . 60 作者简历 . 63 中国农业科学院硕士论文 第一章 绪论 1 第一章 绪论 究意义 磷肥在当今农业生产当中仍是世界粮食增产的重要因素之一， 但磷肥生产不仅要消耗大量的磷矿资源，同时要消耗硫酸等工业原料，而且还导致氟等污染。磷矿粉直接施用还要受其本身的化学、物理性质、土壤和植物等因素影响。鲁如坤（ 1980）认为目前生产上应用最多最广的是高水溶性磷肥，这类磷肥施入固磷能力强的土壤后很快被固定为植物难利用的形态 ,当季利用率很低，一般仅为 1025%，我国南方广泛分布的红黄壤对磷肥的固定则尤为强烈。陈国潮认为我国有 74%耕地土壤缺磷大部分也是由土壤磷固定造成的。如何开发和利用这部分被土壤固定的磷无疑对于当前我国农业生产有非常重要的意义。 大量的研究结果 证明：土壤中存在大量具有一定的的溶磷作用的微生物，主要表现在两个方面，一方面将有机磷转化为无机磷，二是溶解土壤中难溶性的无机磷酸盐（ 957）。有人将其中能够矿化有机磷化合物的微生物称之为溶有机磷微生物；能够将植物难以吸收的无机磷酸盐转化为可直接吸收利用形态的微生物 ,称之为溶无机磷微生物 (或解无机磷微生物 )。当然一些微生物不仅可以溶解无机磷也能吸收有机磷，二者之间并无严格的界定，通称为溶磷微生物。 1957）和 1963）等人的研究表明利用溶磷微生物的特性将 磷细菌作为生物肥料或接种剂不仅节约原料，克服大量施用化肥所带来的环境污染问题，而且可以用来提高难分选的中低品位的磷矿资源利用率；并通过微生物的修复作用，改善土壤环境，使土壤中有效磷含量提高，植物吸磷量增加，生物量和产量均有所提高，具有重大的理论和实践意义。 究现状 壤中的磷 土壤中的磷酸盐化合物可分为原生和次生两大部分。原生的磷矿物主要是磷灰石，其分子组成 F，极难溶于水， 为 120，但易溶于酸。次生的磷矿物又分为无机磷和有机磷。无机磷有沉淀态的和吸附态两种形态， 前者主要是指与铁、铝和钙结合的磷酸盐，其中又有晶质态和非晶质态之分，晶质的以粉红磷酸铁和磷铝石等次生的含磷矿物为代表，非晶质的可以无定型的磷酸铁盐为代表。此类化合物的形成可能有两种过程：一种是原生矿物的转化产物，另一种是在水溶性磷肥施入酸性土壤以后产生的，或者在施入磷酸一钙后，由于其成分溶解的特性，即使在石灰性土壤中也会发生。吸附态磷量的多少与土壤性质和磷肥使用水平有关，它主要存在于粘粒矿物的表面。吸附磷量最高的土壤，如火山灰发育的土壤，它的最大吸附磷量可达 5000一般在自然土壤中吸附态的 磷量是有限的。在中国农业科学院硕士论文 第一章 绪论 2 土壤溶液中，还有极少量的水溶性磷酸根离子，其含量在土壤中一般较低（低于 这是作物磷素营养的重要给源。在一般情况下，无机磷总量约占全磷的 5080%。有机磷化合物的组成很复杂，到现在为止，对其组成和性质较清楚的进展占有机磷的 1/2 左右，包括磷酸肌醇、磷脂和核酸，以及少量的磷蛋白和磷酸糖。有机磷的总量约占土壤全磷量的2050%。土壤中 510%的量是存在于微生物体内， 3050%是以植酸态钙镁存在的（蒋柏藩，1981）。 现代的植物营养理论认为，植物吸收的养分主要是以土壤 液相中的离子态进入植物体内。在通常情况下，磷是以正磷酸盐的形态存在于土壤中，磷酸根离子的形态受土壤的 为 2以绝大部分土壤液相中磷是以 2含量不仅受母质的影响，还受耕作、施肥及自然的侵蚀、磷溶和淀积等影响。但是土壤的全磷量并不能作为土壤磷素供应水平的确切指标，这是因为土壤中的大部分磷素是以迟效态存在的。另外，当无机磷肥施入土壤后，部分溶于土壤溶液中，土壤组分与其反应又将其移出土壤液相，成为生物不 易利用的形态，即磷被固定。土壤磷固定的方式很多，有物理和化学吸附、阴离子交换、表面沉淀、独立固相沉淀等。如以可变电荷矿物为主的土壤磷的固定主要是由于铁、铝氧化物、高岭石、针铁矿等矿物表面磷吸附的结果，这些被吸附的磷与铁或铝相结合，很难用一般的水相平衡解析下来。而对于部分酸性土壤、中性土壤和石灰性土壤磷的固定，则以磷酸盐沉淀为主的方式。尽管磷固定的方式有多种，我们可以把这些方式归结为两类：沉淀和吸附（鲁如坤， 2000；陈国潮， 2001）。 在植被条件较好情况下，除了进入雨水或深层土壤中，或从中因淋溶而损失的极 少量的磷以外，土壤磷的循环实际上是封闭的。在农业生态系统中，由于农产品被取走，以及由于地表径流和侵蚀的影响而使磷遭损失，因而农作物参与的磷素循环是开放的。通过施肥、畜禽粪便以及作物残茬而进入土壤的磷，一方面被土壤和微生物所固定，另一方面由于土壤生物的作用而得以分解和转化。这两个过程是土壤磷素循环中的主要过程， 简单的磷素循环见图 1_1。 图 1中国农业科学院硕士论文 第一章 绪论 3 磷微生物 土壤微生物与土壤磷之间关系的研究始于 20 世纪初。 现一些原本不溶的磷酸盐和天然的磷矿石能 被一些细菌所溶解利用，之后 研究了微生物对植物吸收磷的影响，结果表明：生长于不灭菌土壤中的植物干重比生长于灭菌土壤中的植物增加了 72188%，吸磷量增加了 79340%。他认为这是土壤微生物作用的结果，但他没能对其作用机理作出解释。 50 年代开始，对细菌溶磷进行了更为深入的研究，我国对溶磷细菌的研究也在此时开展，先后有人从东北黑土和灰化土中分离出溶磷能力很强的溶磷芽胞杆菌，中国科学院沈阳生态研究所也从东北黑土中分离出一种极毛杆菌。进入 80 年代开始有人步入溶磷菌的分子机理方面的研究，对于溶 磷机制也有了进一步的探讨， 90 年代以后陆续从范围较广的菌株中克隆出一些相关基因，到目前为止对于溶磷的分子机理的工作仍在开展并有了较为深刻的认识。 磷微生物的种群结构和数量 具有溶磷能力的微生物包括细菌、真菌和放线菌，在土壤中的数量受土壤物理结构、有机质含量、土壤类型、土壤肥力、耕作方式和措施等因素的影响。尹瑞玲发现我国旱地土壤溶磷菌平均为 107g，占土壤微生物总数的 2782%，其中细菌所占比例最大。溶磷细菌数量因土壤类型而异，黑钙土溶磷菌最多，为 107g，瓦碱土 最少，仅有 2104g。林启美在研究不同生态系统的土壤中溶磷细菌数量时发现溶磷菌不仅总数差异很大，而且在细菌总数中占的比例也有很大的差异。另外溶磷菌的分布表现出强烈的根际效应 ,即根际土壤的数量比土体要多 ,但并不是根际微生物的优势菌落。 目前报道的溶磷细菌主要集中在芽胞杆菌属 (假单胞菌属 (埃希氏菌属 (欧文氏菌属 (土壤杆菌属 (沙雷氏菌属(黄杆菌属 (肠细菌属 (微球菌属 (固氮菌属 (沙门氏菌属 (色杆菌属 (产碱菌属(节细菌属 (多硫杆菌属 (些种。 关于溶磷真菌的研究由于技术手段等问题见于报道的相对较少，但其也有溶磷能力强的特点，目前研究主要集中在青霉属 (曲霉属 (根霉属 (如加拿大的应用面积和效果均很理想，范丙全（ 2001）则在石灰性土壤上进行了溶磷微生物的筛选，并进一步对溶磷草酸青霉菌的溶磷效果、溶磷能力、活化土壤难溶磷的种类、对作物的生长和溶磷机理进行了较为系统的研究。 958)首次报道了一株放线菌（ 酸种类与溶磷的关系， 980)的研究显示放线菌兼具有分解有机磷的能力， 982)分离到了第一株链霉菌，使培养基的 降低 ,能溶解磷酸三钙和磷矿石，其后 983)报道他们分离了两株放线菌（链霉菌）均具有溶磷作用。当前对溶磷放线菌的研究对象绝大部分为链霉菌属 (研究层次多集中在对新的溶磷菌株的筛选、溶磷效果分析等方面。 中国农业科学院硕士论文 第一章 绪论 4 生物溶无机磷的机制 微生物溶磷机理非常复杂，有些微生物溶磷主要是质子起作用，有些主要是有机酸起作用，而有些菌株则两种机制都存在 ,还有些菌株由于生长过程中产生其它的螯合物质 ,从而导致磷矿粉的溶解。其它也有人认为有机酸的种类比产酸的量对于溶磷效果有 更重要的意义。 分泌有机酸是许多微生物代谢活动常见的现象，细菌分泌的有机酸主要是草酸、酒石酸、丙二酸、乳酸和乙酸，真菌分泌的有机酸主要是草酸、丙二酸和乳酸。不同菌株之间分泌有机酸的数量和种类差别都非常大，最高的达 124，最低的只有 。微生物在生长代谢中产生的有机酸一方面可以溶解土壤中难溶性磷酸盐，另一方面还具备鳌合作用（ 将分离得到的 100 多种细菌涂布于以钙磷灰石为唯一磷源的培养基上，发现在菌落周围产生溶磷圈，认为这是产生 的乳酸和 2解的机理是酸化和钙离子的螯合作用， 发现细菌产酸与溶磷有一定的相关性。林启美等发现培养介质酸度升高是溶解磷矿粉的重要条件，但不是其必要条件。也有人发现溶磷量与培养介质的 间缺乏相关性，甚至有与此相反的结果，例如某些细菌不分泌任何酸性物质，几乎不提高培养介质的酸度，甚至降低了培养介质的酸度，但仍然具有强烈的溶解磷矿粉活力。不同的有机酸与铁、铝、钙、镁等金属离子结合能力存在巨大的差异。 现微生物分泌的有机酸种类比数量更加重要。 现尽管微生物与葡萄糖酸的分泌存在显著的相关性 (从介质中吸收无机磷。如果将 调整为普通微生物代谢最适值，矿化速度将提高，同时从酸性改变到中性会增加磷酸的释放。另外较高的温度也促进分解作用，如热带地区有机磷矿化速度高于 温带地区，富含有机磷的土壤生物矿化作用则非常活跃。 磷素的矿化作用（或固定作用）与氮素有关。通常，磷素释放在有利于氨化作用的条件下速度是最快的。因此，一些实验中可观察到二者之间存在重要的相关性，矿化的氮是磷成为有效数量的 815 倍，同样 C（ 释放）和磷的矿化之间也有一定的相关性，大约100300： 1 的比例。这说明在均衡的条件下微生物的矿化的 C:N:P 的比例类似于这三种元素在腐殖质中的比例。 土壤中许多有机磷可以在三种酶（磷酸酯酶，酯酸酶，磷酸激酶）的作用下转变成植物可以利用的磷。如宋春勇（ 2001） 在缺磷土壤中施用植酸和卵磷脂时接种几种菌根真菌（ ，对根际土壤测定表明：菌根菌增加了土壤酸性磷酸酶和碱性磷酸酶的活性，从而促进了土壤难溶性有机磷矿化及玉米和红三叶草对磷的吸收。 菌磷代谢的特点 磷是微生物合成作用必不可少的重要元素，微生物区系的 形成 受栖居地中可利用的磷化合物数量的支配。如果磷浓度大于微生物营养要求，则超过部分以无机磷酸盐的方式释放出来，如果不能满足微生物区系生长要求，则表现为固 定作用。在缺磷环境时，磷将会被微生物吸收利用。 1992）等研究细菌和浮游植物对难溶有机磷和无机磷的吸收时发现：细菌只在有机碳或者其他营养盐可利用性受到限制时，才对磷的利用限制。 磷饥饿状态的绿藻和假单胞菌进行培养，发现假单胞菌对磷的吸收服从力学方程，而且二者在足够的碳源的情况下都会发生对低浓度的磷和高浓度磷的竞争。周岳溪等人（ 1994 年）对于废水处理中的假单胞菌的磷摄取和释放条件进行了研究，发现缺磷的环境将会导致假单胞菌 的过量摄磷现象，而且无论经过无碳厌氧、无碳好氧亦或无硫厌氧、无硫好氧的培养后，在富磷的培养基内都会发生过量摄磷的现象。 菌磷代谢的分子调控 细胞中的磷代谢是复杂的 ， 但从根本上来说 ， 任何磷化合物的利用需要分两步来进行 ，即磷的吸收和无机磷合成 之后再利用 成多种化合物。对于微生物磷代谢调控一般来说有两种说法：质子动势和 节系统。在物质进出细胞的过程中 ， 主动转移是对于营养吸收的一种主要的形式 ， 其所需的能量大多来源于质子动势 ( 它是质子化学梯度和膜电势梯度的总和。田淑媛 等经研究实验后认为 ， 从细菌学角度来说 ， 细菌质子移动力中国农业科学院硕士论文 第一章 绪论 6 在吸磷和释磷过程中起决定性作用 ， 主要是控制 粒在细胞内的积累和消耗 ， 其研究认为醋酸盐的释放量与净磷酸盐的消耗量成正比关系。厌氧条件下溶磷菌中的 速合成 ， 好氧时溶磷菌富养则消耗大量的 内源物质 ， 产生 外部的磷主动转运到体内合成 时也对产碱菌 ( 粒进行了研究 ， 发现在营养充足的情况下 ， 采用动力学分析醋酸盐对细胞的生长速率和 形成的影响 ， 其生长的速率随着醋酸盐浓度的增加而降低 ， 并遵循指数生长曲线。 夏琪等认为细菌的磷代谢的分子调控机制由一种两组分调节系统 控制。它是由结构和功能类似的两种蛋白族的成员组成的一类信号传导系统 ， 它控制着磷的最终归宿。这一系统控制着一大类细菌适应性的反应 ， 磷的代谢始终与 控子息息相关。在分子生物学水平上 ， E. 酸盐调节子称为 节子 ， 由 20 多个不相连的磷酸盐调节基因组成 ， 这些调节基因受磷酸盐饥饿的诱导 ， 培养基中无机磷酸根离子 (浓度逆向调节这群基因 ， 而 子正向激活它们。 子是 因的表达 产物 ， 是典型的 能结合在被调节的启动子上游的特异靶序列。当细菌感受到低磷胁迫时 ，会起着自身磷酸化酶和蛋白激酶的双重作用 ， 使 酸化 ， 磷酸化的 活节子的基因转录 ， 使细菌细胞加快磷转运速率和诱导 因合成大量的胞内碱性磷酸酶并分泌到细胞的周质空间。 磷效果的研究方法 微生物溶磷能力的测定一般可分为定性和定量两种方法，定性的以平板法为代表，即将溶磷菌株在含有难溶性磷酸盐或有机磷的固体培养基上培养，测定周围菌落周围产生透明圈的大小，这是一种简单而方便的定性检测磷细菌的方法。在此基础上，有人在培养基里添加缓冲剂以便更进一步评价溶磷效果。 定量的测定包括液体培养法和土壤（或沙培）培养法，前者测定培养液中可溶性磷的含量，后者在土壤浸提液中测定其有效磷的含量。在液体培养法中如何将溶磷菌分解的无机磷浸提出来并加以测定，不同的研究者采用的方法可分为：培养液过滤法，离心取上清法，熏蒸、消煮法等。对处理后的培养液中磷含量则一般采用钼蓝比色法，其原理是利用一定的酸度条件下，加钼酸铵于含磷的溶液中，溶液中的正磷酸与钼酸络合形成磷钼杂多酸。在适宜试 剂浓度下，加入适当的还原剂（如抗坏血酸），使钼磷酸中的一部分 子被还原为生成一种叫做“钼蓝”的物质，当将含不溶性无机磷的培养液经钼磷试剂处理后，则培养液发生颜色变化，通过比色法间接求出培养液中水溶性磷的含量。 同位素示踪法：通过测定植物体内 32P 的增加量来测定菌体的溶磷效果。具体方法是在含标记有 32P 的不溶性磷化合物（有机磷或无机磷）的培养基内接种供试菌株，使菌体在培养过程中吸收 32P，再用含 32P 的菌体培育植物幼苗，同时以仅含 32P 而不含菌体的培养基为对照。测定该植株由标记的菌体内吸入的 32P 量比对照的增加量，即可得到结果。 中国农业科学院硕士论文 第一章 绪论 7 磷细菌的促生作用 当磷细菌作为生物肥施入田间时，在磷细菌和植物根系形成的微生态中，植物根部的脱落物和分泌物不断地向磷细菌提供营养，加速其生长；同时磷细菌产生的剩余有效磷提供给植物，刺激植物快速生长，溶磷反应的产物不断的被植物吸收，根际微生态中的溶磷动力学的平衡点向形成产物的方向移动。有的微生物在溶磷的同时还具有促生作用，从而利于农作物的生长。 大量实验结果揭示，溶磷微生物除了具有溶解土壤和外源难溶磷的作用，还有能够提高作物产量的效果，其增产的机制是多方面的 ： 溶磷作用和促进作物对磷的吸收 溶磷微生物的溶磷作用为作物提供了较多的磷素，对作物的生长具有非常重要的作用，如 1995)报道，溶磷微生物与固氮菌单一接种和混合接种都能提高大麦的产量。他认为二者交互作用的机理是为作物提供了较平衡的营养和改善的作物根系对 N、 P 的吸收。 分泌植物激素物质 有些溶磷微生物除了具有溶磷活性还在植物根际分泌一些植物激素，从而起到促进作物生长的效果。 1976）从根际分离出 50 株溶磷细菌，对它们产生的激素进行分析，结果表明，有 20 株分泌 霉素 细胞分裂素 ， 43 株产 9 株产生赤霉素， 45 株产细胞分裂素。而 1978）则观察到溶磷菌株 两株产生 3 1999）对从小麦根际分离出的 164 株溶磷菌进行化学诱变，得到 5 株突变株，随后进行溶磷能力和 果显示，野生菌和突变株都能产生 而可以认为，某些菌株可通过分泌的激素物质对植物的生长起到促进作用。 溶磷微生物抑制病原菌生长 一些研究表明，溶磷微生物 具有抑制土壤病原菌，降低病害的作用。 1968）在田间用溶磷菌 为玉米种子包衣，能够显著抑制由 f. sp 粉镰刀菌）引起的玉米苗腐病，取得了与杀菌剂拌种相同的效果。类似的研究也揭示出一些溶磷微生物具有抑制病原菌和减轻病害的作用，但这并不能肯定所有的溶磷微生物都具有这种特性。 植物和细菌的生长动力学有相互关系，因为它们的生长经常被同一种营养源所限制，这种限制性营养源主要是有效磷。有效 磷是刺激细菌和植物生长的因子，但对植物的刺激作用远大于对细菌的作用。刘丽丽在纯培养摇瓶试验中发现初期磷细菌在新的生长环境 (磷矿粉为唯一磷源 )中，处于适应期，此时有少量有效磷存在，这些磷源完全可以刺激磷细菌生长。适应期以后，磷细菌快速生长，并在其生长代谢过程中迅速将无效磷转化为有效磷，随时间的推移，有效磷的量也随之升高。另有研究亦指出根际微生物的活性及其群落结构对植物磷素营养影响很大，即植物根际磷细菌的数量影响根际磷营养的可给性。在这个过程中磷细菌可以将无效磷转化为植物营养磷，并且随磷细菌数量增加而增加，在一 定范围内随土壤中全磷特别是无效磷 (磷矿粉 )量的增加而增加。另一方面，对于长期施用化肥，特别是已经造成土壤板结的耕层，在施用磷细菌生物肥后，将对活化土壤、增加磷营养的可给性带来很大改善。 中国农业科学院硕士论文 第一章 绪论 8 菌溶无机磷相关基因的研究 溶磷微生物的研究从上个世纪 80 年代进入了分子生物学水平，其中对溶磷细菌促进无机磷溶解的研究相对较多。其中 草生欧文氏菌（ 克隆到的咯并喹啉醌 )合成基因 (具代表性，其编码产物可以促进细菌对无机磷的溶解利用，该基因 编码产物是 径中葡萄糖脱氢还原酶的辅酶，能对细菌利用葡萄糖并产酸起到关键作用。 该基因亚克隆并融合到广范围质粒载体（ 构建重组质粒 大肠杆菌中表达，然后再转化到洋葱假单胞菌（ 成团肠杆菌（ ，利用三亲本杂交技术，在以磷酸三钙为唯一磷源的选择性培养基中获得的转化子显示出具有较大的溶磷圈。之后 隆到 因。 从洋葱假单胞菌（ 中分离出基因 存在于细胞膜上的组氨酸通透酶系统中的膜结合蛋白 有高度同源性，推测它可能与膜的通透性相关，编码某种调节 成的蛋白，但与目前已克隆到的 因无同源性。从上面的研究可以发现因对细菌溶磷机制并未完全清楚，所以克隆到的有关细菌促进无机磷溶解的基因大多与细菌产酸有直接关系或起调解作用，至于其它种类的溶无机磷基因尚未有明确报道。 菌种群的现代鉴 定技术 一般来说，细菌种群的鉴定方法包括两大类，即表型的方法和遗传学的方法。生物的表型信息来源于蛋白质及其功能、各种不同的化学标示、以及大量的诸如形态、生理生化、免疫等特征的表达，因此表型的方法就是对这些特征的测定。常用的表型方法主要有：全细胞可溶性电泳分析、多位点酶电泳分析、全细胞脂肪酸分析、血清学反应、胞外多糖分析等。而遗传学方法根据生物核酸分析的遗传特征作为分类指标，能较为客观地反映微生物的亲缘关系。随着分子生物学技术的应用于发展，各种有关核酸的分析技术被大量引入到微生物分类研究中。这些方法归结起来是 在三个层面的细菌遗传物质上进行分析的： 1）在细菌总基因组层面上的分析方法。主要包括随机扩增 段的多态性（ 纹图谱分析、扩增片段长度多态性（ 纹图谱分析、基因组 碱基组成（ G+测定和基因组 交同源性分析等。 2）在具有进化比较意义上的特定基因或序列层面上的遗传分析。主要包括 16S 因、 23S 因及其基因间隔区序列等基因的序列分析及各类酶切电泳图谱分析或探针杂交方法。这些方法不仅可以在分类中对大量菌株进行遗传学上的分群，而且是系统发育树 建树的主要依据。尤其是 16S 因的序列测定比较分析是目前细菌分类的主要数据来源。 3）基于染色体外遗传物质层面上的研究，这里一般指细菌质粒类型的电泳图谱分析。当前分类方法多种多样，尤其是遗传学分类方法更是浩如烟海，目前还在不断的发展中。在实际操作中，人们则将表型的方法和遗传学的方法结合起来开展工作。下面就本论文中涉及到的一些方法简介如下。 中国农业科学院硕士论文 第一章 绪论 9 生物全自动鉴定系统 用于细菌快速鉴定的方法和技术很多，近年已相继开发出一些微生物鉴定系统。例如统、 统、 统及 统等。其中 统利用细菌对 95种不同碳源的代谢情况来鉴定菌种，即每种菌种形成各自特有的代谢指纹图谱，选用四唑紫作为细菌能否利用供试碳源的指示剂，其中碳源包括糖、醇、酸、胺、酯和大分子聚合物。种化学鉴定方法在于分析细菌代谢的氧化还原过程而不是他们的代谢副产物（如产酸、产气）。细菌如果能利用供试碳源，则某种碳源的孔显示紫色。经计算机自动与数据库内已知菌比较，可把供试菌株鉴定到种、亚种水平上。 该系统主要由系统软件、计算机系统、高精密阅读器、微量检测板、浊度计、 8 通道移液器及 其他辅助设备组成。其中系统软件中主要包括革兰氏阴性菌数据库（ 革兰氏阳性菌数据库（ 厌氧菌数据库（ 、酵母菌数据库（ 丝状真菌数据库（ 其他辅助运行软件。其中 4 个属；G+菌包括 46 个属。目前 生物自动鉴定系统是一种具有较高标准化和自动化程度的专家鉴定系统，它能快速、准确的鉴定菌种，国际上已承认该鉴定系统。由于它因具有数据库大，鉴定范围广，自动化程度高、操作简便、快 速鉴定菌种等优点，已经广泛应用于临床、兽医、生物技术、药物、食品和水、生物防治、植物病理、海洋生物、微生物生态和科研等方面。 于 16S 列的方法 原核生物 (细菌和古生菌 )核糖体的 有 3 种类型： 23S、 16S 和 5S 们的大小分别为 2900、 1540