【毕业学位论文】极端环境中嗜铁钩端螺旋菌的选择性分离、鉴定与特性研究-管微生物学博士论文

博士学位论文 极端环境中嗜铁钩端螺旋菌的选择性分离、鉴定与特性研究 作 者 姓 名：高 健 研 究 方 向：微生物学 院、系（所） ：资源加工与生物工程学院 指 导 老 师：邱冠周 教授 中 南 大 学 2007年 3月 博士学位论文 密级 博士学位论文 极端环境中嗜铁钩端螺旋菌的选择性分离、鉴定与特性研究 on 者 姓 名：高 健 研 究 方 向：微生物学 院、系（所） ：资源加工与生物工程学院 指 导 老 师：邱冠周 教授 论文答辩日期 答辩委员会主席 中 南 大 学 2007 年 3 月博士学位论文 录 摘 要 . I . 一章 文献综述 .生物冶金的定义 .生物冶金的历史与现状 . 微生物冶金的历史 . 微生物冶金的现状 . 微生物冶金的反应机理 . 冶金微生物的研究现状 .论文研究的目的与意义 .论文的主要研究内容 . 嗜铁钩端螺旋菌的选择性分离 . 螺旋状铁氧化细菌的生理特性与鉴定 . 嗜铁钩端螺旋菌 因的克隆与序列分析 . 嗜铁钩端螺旋菌的遗传多样性 . 嗜铁钩端螺旋菌中磁性纳米颗粒的分离 . 不同铁氧化细菌合成的沉淀差异性分析 . 一株分离于酸性矿坑水的酵母菌的特性与分子鉴定 .论文课题来源 .二章 嗜铁钩端螺旋菌的选择性分离 . 言 .料与方法 . 液体样品来源 . 仪器、试剂与培养基 . 培养技术路线 . 结果与分析 .章小结 .三章 螺旋状铁氧化细菌的生理特性与分子鉴定 .言 .料与方法 . 菌株与培养基 . 试剂与仪器 . 生理生化特征 . 对黄铁矿的浸出效果 . 对黄铜矿的浸出效果 . 基因组 提取 . 基因组 G+C 含量的测定 . 16S 增、克隆、测序与序列分析 .士学位论文 6因间隔区序列的 增与电泳分析 .果与讨论 . 生理特征 . 因组G+C 相对百分含量 . 16S . 16隔区（物的电泳分析 .章小结 .四章 嗜铁钩端螺旋菌 (L. 因的 增、克隆与序列分析 . 言 .料与方法 . 菌种和培养条件 . 试剂和引物合成 . 嗜铁钩端螺旋菌 因组 提取 . 因 增的简并引物的设计 . 因的 增 . 物的克隆与测序 .果与分析 . 因 增的简并引物的设计 . 株 因的 增 . 因的序列分析 .论 .章小结 .五章 嗜铁钩端螺旋菌的遗传多样性分析 . 言 .料与方法 . 菌株 . 基因组 取 . 增 . 物的克隆与测序 . 序列分析 .果与讨论 . 16S 列分析 .章小结 .六章 嗜铁钩端螺旋菌（ L. 天然磁性纳米颗粒的分离与纯化 . 言 .验材料和方法 . 菌株与生长条件 . 无铁离子细胞的制备 . 超薄切片样品的制备 . 磁性颗粒的提取与纯化 . 透射电镜观察与 谱分析 .果与讨论 .士学位论文 描电镜下 L. 基本形态 . 透射电镜下 L. 胞内的磁性颗粒形态 . 磁性颗粒的透射电镜观察与能谱分析 .章小节 .七章 不同铁氧化细菌作用下形成的沉淀差异性分析 .言 .验材料与方法 . 仪器 . 菌 种 . 培养基与细菌培养条件 .淀的收集 .淀的鉴定 .验结果与分析 . 沉淀的化学成分分析 . 沉淀的扫描电镜分析 . 沉淀的 析 . 沉淀的 析 .章小节 .八章 一株分离于酸性矿坑水的异养菌的特性与分子鉴定 . 言 .料与方法 . 株的分离与纯化 . 株基因组 提取 . 18S 26S 2 区的 增 . 增产物的纯化与测序 . 序列分析和系统树的构建 . 对 株的生长活性影响 . 株对不同金属离子的抗性特征 .果与分析 . 菌株的形态学特征 . 系统发育分析 . 论 .论 .考文献 . 谢 .读学位期间主要的研究成果 .士学位论文 各种证据表明，在温度40、端螺旋菌在工业连续流生物反应槽中属于主要的铁氧化细菌。目前，在钩端螺旋菌属现存的三个种当中，仅仅嗜铁钩端螺旋 菌能够在 45生长，此外，除了两个抗砷基因被鉴定外， 有关这个种的其他生物学特性的报道非常有限。因此，它已成为未来生物学研究的热点。 然而，由于纯培养的困难，有限的嗜 铁钩端螺旋菌菌株被分离。在本研究中， 以嗜铁钩端螺旋菌为主要研究对象， 开展了其分离方法、生理生化特性、分子生物学鉴定和磁小体的提取等研究工作，其主要内容如下： 1. 建立了一种分离嗜铁钩端螺旋菌的选择性方法。 目前，分离嗜铁钩端螺旋菌的最成功方法是双层平板法。其特点是采用了双层平板以及异养细菌- 管这种方法在铁氧化细菌的分离方面非常有效， 但双层平板的制备比较繁琐，加入的此，我们根据钩端螺旋菌适宜的生长温度、某些生 理生化特性，建立了一种相对简单有效的选择分离性方法， 其主要特点是给嗜铁钩端螺旋菌提供有利的生长条件，如低 、较高培养温度（40）和较高氧化还原电位等。基于这种方法，经过连续稀释，我们获得了 12 株嗜铁钩端螺旋菌纯培养物。此外，还用酵母替株进行了双层平板分离嗜铁钩端螺旋的尝试。 2. 以 株为研究对象，从形态学、生理生化及分子水平等方面进行了鉴定。 钩端螺旋菌属的各个成员之间在形态学和生理学上并没有明显的差异。形态学表明，而，基于以下几种证据，证明 45时的生长能力。 与嗜铁钩端螺旋菌典型菌株 一致性； 基因组G+ 与表32中其他菌株间16 对黄铁矿高效的浸出能力与对黄铜矿有限的浸出能力。 博士学位论文 嗜铁钩端螺旋菌 因的增与克隆 有关嗜铁钩端螺旋菌 因的研究还未见相关报道。在本研究中，采用本研究室设计的一对寡核 苷酸简并引物，首次报道了嗜铁钩端螺旋菌 因的增与克隆， 该基因的克隆为嗜铁钩端螺旋菌分子系统学的研究提供了分子标记 。 4. 嗜铁钩端螺旋菌的 16S 因的序列分析 从功能基因 16S 因的角度探讨了嗜铁钩端螺旋菌不同菌株间的系统发育关系。结果表明： 探测到了 14 个信号位点， 其中9个信号位点分布于470490位点之间。这些信号位点很有可能被用作识别嗜铁钩端螺旋菌不同菌株间的一种分子标记； 15 株嗜铁钩端螺旋菌可分成明显的三组。相似性比较发现，系统发育间的相似性与矿物学特征间很可能存在某种必然的相关性； 5. 磁小体的分离与纯化 首次通过蔗糖密度梯度离心和从透射电境表明， 磁性颗粒近似球形， 平均直径为44粒的大小属于单磁畴结构；能谱分析表明，这种磁性纳米颗粒主要由铁和氧两种元素组成。由此初步推 断，这种颗粒就是磁小体。 6. 不同铁氧化细菌作用下形成的沉淀差异性分析 通过不同温度条件下，对不同铁氧化细菌作用下形成的 赭黄色高铁沉淀进行了分析。结果表明，无论是嗜铁钩端螺旋菌L. 还是嗜酸氧化亚铁硫杆菌作用下形成的沉淀都是黄钾铁矾和黄铵铁矾的混合物。其中，而黄铵铁矾的含量比 7. 酸性矿坑水中极端嗜酸又能耐受中强碱酵母的分离与鉴定 采用平板划线分离法，从江西 某铜矿酸性矿坑水中分离出一株极端嗜酸、又能耐受中度碱性条件的异养微生物，命名为 株。该菌株能在 范围内生长。形态学以及 18S 26S 1/序列分析表明， 株属于 P. 属抗性试验表明，该菌株对重金属铜离子的抗性可高达 45，因博士学位论文 的分离为研究极端环境中微生 物的抗铜机制提供了材料。 关键词： 嗜铁钩端螺旋菌，菌种分离 ，分子鉴定，磁小体， P. ll of in of . as a of to to 5C . as a of to on . In on . . of in as 1. A . At to of a an is